【摘要】：局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)作為導(dǎo)致成人及兒童激素抵抗腎病綜合征和腎功能衰竭最常見(jiàn)的原因之一,其病理生理機(jī)制仍不清楚。FSGS診斷依靠腎活檢,其病理特征包括局灶節(jié)段性腎小球硬化,和足突的彌漫融合。然而,由于病變小球往往位于皮質(zhì)深部接近髓質(zhì)處,腎活檢易遺漏,給FSGS的診斷帶來(lái)一定困難。FSGS根據(jù)病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和家族性。家族性FSGS(Familial FSGS,FFSGS)也叫遺傳性FSGS,占非繼發(fā)性FSGS 9%左右。FSGS患者臨床通常表現(xiàn)為大量蛋白尿,部分表現(xiàn)為腎病綜合征范圍的蛋白尿,對(duì)這部分患者治療主要包括激素和免疫抑制劑,根據(jù)對(duì)足量激素的療效可分為激素敏感、激素依賴和激素抵抗,激素依賴和抵抗患者容易進(jìn)展至終末期腎臟病(ESRD)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)情況的研究方法。以往報(bào)道關(guān)于FSGS的轉(zhuǎn)錄水平的研究,采用材料多來(lái)自腎組織(包括腎小球和小管間質(zhì))的石蠟標(biāo)本,由于FSGS為足細(xì)胞疾病,納入腎小管和間質(zhì)將造成結(jié)果偏差,此外石蠟組織中RNA的降解難以避免。因此,本研究在倒置顯微鏡下分離FSGS患者活檢腎組織中的腎小球,最大限度的保持患者腎小球轉(zhuǎn)錄本的完整性。并通過(guò)高通量的Microarray分析方法直接對(duì)患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究,以期從轉(zhuǎn)錄水平上,發(fā)現(xiàn)FSGS的發(fā)病機(jī)制。此外,本研究不僅入選原發(fā)性FSGS患者,還入選攜帶基因突變的遺傳性FSGS患者和激素抵抗FSGS患者,將從不同角度,全面探討FSGS的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異,從而深入了解FSGS的致病機(jī)制。本研究第一部分納入6例原發(fā)性FSGS患者,5例MCD患者,兩組患者接受腎穿刺時(shí)均未接受激素和/或免疫抑制劑治療,且所有入組患者都表現(xiàn)為激素敏感,排除治療反應(yīng)的差異對(duì)Microarray結(jié)果的影響。倒置顯微鏡下極細(xì)尖頭鑷分離患者腎活檢皮質(zhì)組織中腎小球,對(duì)兩組患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行microarray分析,重點(diǎn)對(duì)兩種疾病的基因表達(dá)的差異進(jìn)行了詳盡的分析。microarray結(jié)果提示,fsgs與mcd患者腎小球轉(zhuǎn)錄本相比:參與生殖細(xì)胞形成、泛素化過(guò)程、蛋白刺激反應(yīng)、肌肉收縮的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增生和骨骼系統(tǒng)發(fā)育的基因高表達(dá);而參與合成和分解代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞定位的形成的基因低表達(dá)。并通過(guò)rt-pcr方法在另外7例fsgs與7例mcd患者腎小球轉(zhuǎn)錄本中驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)與microarray結(jié)果一致。并發(fā)現(xiàn)膜金屬肽鏈內(nèi)鈦酶(membranemetalloendopeptidase,mme)蛋白在fsgs患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于mcd患者,提示mme可作為潛在的區(qū)別fsgs、mcd的生物學(xué)標(biāo)志物,同時(shí)提示mme可能參與fsgs的發(fā)生。除了原發(fā)性fsgs,以往研究發(fā)現(xiàn)一部分家族性fsgs患者為足細(xì)胞相關(guān)分子突變引起,提示與原發(fā)性fsgs存在不同機(jī)制。本課題組前期研究在漢族人fsgs家系中成功發(fā)現(xiàn)col4a3基因雜合突變可引起漢族人家族性fsgs。本研究第二部分,納入3例攜帶iv型膠原α3鏈(col4a3)基因突變的ffsgs患者(c1616y,g801r,l737h)和5例mcd患者。通過(guò)對(duì)其臨床資料的回顧性整理統(tǒng)計(jì),觀察ffsgs與mcd兩組患者臨床特點(diǎn)的差別,結(jié)果顯示與mcd相比,攜帶col4a3基因突變ffsgs患者發(fā)病較早,較少發(fā)生腎病綜合征,合并鏡下血尿較多,尿蛋白水平較低,血漿白蛋白水平較高,腎活檢時(shí)ffsgs患者腎小球?yàn)V過(guò)率較低。對(duì)兩組患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行microarray分析,結(jié)果顯示攜帶col4a3基因突變的ffsgs患者腎小球轉(zhuǎn)錄本與mcd患者腎小球轉(zhuǎn)錄本相比,參與細(xì)胞間及細(xì)胞表面受體信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)信號(hào)傳遞、認(rèn)知、感官直覺(jué)、g蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的基因呈現(xiàn)高表達(dá);而參與合成及分解代謝、蛋白質(zhì)裂解及泛素化過(guò)程,和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的基因呈現(xiàn)低表達(dá)。挑選前6位上調(diào),和前6位下調(diào)表達(dá)的基因,采用rt-pcr方法在相同患者腎組織轉(zhuǎn)錄本中驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì),結(jié)果顯示相關(guān)基因表達(dá)趨勢(shì)與microarray結(jié)果一致。gbm主要由iv型膠原(col4a3)組成,在臨床工作中,一部分fsgs患者活檢腎組織gbm在em下呈節(jié)段性改變,但該病理改變的機(jī)制以及臨床意義不明。此外,先前研究本課題組發(fā)現(xiàn),col4a3基因雜合突變攜帶者可見(jiàn)gbm節(jié)段性變薄,與典型薄基底膜腎病(tbmn)以及as的電鏡下特征不同。因此我們通過(guò)分析合并gbm節(jié)段變薄的fsgs患者與gbm無(wú)病變的fsgs患者的臨床、病理數(shù)據(jù),以期發(fā)現(xiàn)gbm節(jié)段變薄對(duì)患者臨床、病理以及預(yù)后的影響。通過(guò)對(duì)63例合并gbm局灶變薄的fsgs患者與60例gbm無(wú)病變的fsgs患者臨床資料的比較分析,結(jié)果顯示與gbm無(wú)病變的fsgs患者相比,合并gbm局灶變薄的fsgs患者尿蛋白水平明顯較高,血漿白蛋白水平較低,腎小球?yàn)V過(guò)率較低,且血紅蛋白水平較低。兩組患者腎病綜合征、血尿的比例,病理表現(xiàn)以及治療反應(yīng)未見(jiàn)明顯差異。fsgs的主要治療包括激素和免疫抑制劑,根據(jù)以往數(shù)據(jù)顯示,大約1/3fsgs患者對(duì)激素治療反應(yīng)差,但具體機(jī)制不明。本研究第三部分通過(guò)納入6例臨床表現(xiàn)為激素敏感腎病綜合征(ssns)的原發(fā)性fsgs患者,3例臨床表現(xiàn)為激素抵抗腎病綜合征(srns)的原發(fā)性fsgs患者,對(duì)兩組患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行microarray分析,觀察兩組患者基因表達(dá)的差異。結(jié)果顯示與fsgs-ssns患者腎小球轉(zhuǎn)錄本相比,fsgs-srns患者腎小球轉(zhuǎn)錄本中:參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸及其衍生物代謝,離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的基因呈現(xiàn)高表達(dá);而參與人體器官組織形成、dna依賴的轉(zhuǎn)錄過(guò)程調(diào)節(jié)、mapk活性的負(fù)向調(diào)控的基因呈現(xiàn)低表達(dá)。rt-pcr驗(yàn)證結(jié)果顯示相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)與microarray結(jié)果一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示stra6(stimulatedbyretinoicacidgene6homolog)基因編碼蛋白在fsgs-srns患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于fsgs-ssns患者。提示stra6的低表達(dá)可能與srns的fsgs發(fā)生有關(guān),因此,我們提出stra6可作為鑒別fsgs治療反應(yīng)的潛在的生物學(xué)標(biāo)志物,同時(shí)提示stra6可能參與fsgs-srns的發(fā)生。綜上所述,本研究入選臨床特征為ssns的原發(fā)性fsgs患者,遺傳性fsgs患者(攜帶col4a3雜合突變)和srns的fsgs患者,入選mcd患者作為對(duì)照組,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,得到了fsgs的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)圖譜。結(jié)果顯示:ssns患者,遺傳性fsgs患者與mcd患者腎小球轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異明顯。與ssns患者相比,srns患者腎小球轉(zhuǎn)錄本差異明顯。差異表達(dá)的基因中,參與生殖細(xì)胞形成、泛素化過(guò)程、合成和分解代謝過(guò)程等的基因在ssns和mcd患者中表達(dá)差異明顯;參與細(xì)胞間及細(xì)胞表面受體信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)信號(hào)傳遞、認(rèn)知、感官直覺(jué)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的基因;參與合成及分解代謝、蛋白質(zhì)裂解及泛素化過(guò)程,和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的基因,在遺傳性FSGS和MCD患者中表達(dá)差異明顯;參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸及其衍生物代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、人體器官組織形成、DNA依賴的轉(zhuǎn)錄過(guò)程調(diào)節(jié)等的基因在SRNS與SSNS患者中表達(dá)差異明顯。MME基因及其編碼蛋白在FSGS患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于MCD患者,提示MME可作為潛在的區(qū)別FSGS、MCD的生物學(xué)標(biāo)志物,同時(shí)提示MME可能參與FSGS的發(fā)生。STRA6基因及其編碼蛋白在SRNS的FSGS患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于SSNS的FSGS患者。提示STRA6可作為鑒別FSGS治療反應(yīng)的潛在的生物學(xué)標(biāo)志物,同時(shí)提示STRA6可能參與FSGS-SRNS的發(fā)生我們發(fā)現(xiàn)一部分散發(fā)性FSGS患者也表現(xiàn)為GBM節(jié)段性變薄,進(jìn)一步分析合并與不合并GBM節(jié)段變薄的FSGS患者的臨床、病理和預(yù)后差異,發(fā)現(xiàn)合并GBM節(jié)段變薄的FSGS患者腎小球?yàn)V過(guò)率較低,尿蛋白水平較高,血漿白蛋白水平較低,提示這部分患者臨床表現(xiàn)較重。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692.6

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本文編號(hào)：2398546