【摘要】：目的意義：同源異型蛋白PROX1(prospero-related homeobox)是果蠅Prospero蛋白在脊椎動(dòng)物中的同源物。人類(lèi)PROX1基因在1996年被首次分離,位于人類(lèi)染色體1q32.2-q32.3,基因組由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。PROX1基因的cDNA全長(zhǎng)為2924bp,編碼包含737個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子量為83kDa。近年研究證實(shí),PROX1蛋白可調(diào)控細(xì)胞分化,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、晶狀體、視網(wǎng)膜、肝臟、胰腺及淋巴管等多種組織器官胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí),在人類(lèi)多種腫瘤中檢測(cè)到PROX1異常表達(dá)。一方面,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、肝癌中PROX1呈高水平表達(dá),且PROX1可增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；另一方面,在胰腺癌、乳腺癌、白血病等腫瘤中由于DNA甲基化作用引起PROX1表達(dá)下調(diào),且PROX1表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān),PR OX1表達(dá)水平高的患者預(yù)后良好。正如在胚胎發(fā)育過(guò)程中PROX1作用的發(fā)揮具有組織特異性一樣,在不同類(lèi)型的腫瘤中,PROX1即可表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤侵襲的作用亦可扮演抑制腫瘤進(jìn)展的角色,表明PROX1在人類(lèi)腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是確定PROX1基因在腎癌中的表達(dá)特征,探討其在腎癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用,并進(jìn)一步探索潛在的分子機(jī)制,為腎癌的防治提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法：1、采用RT-qPCR、Western blot或免疫組織化學(xué)方法明確PROX1在人腎癌組織、癌旁腎組織、人腎癌細(xì)胞系及腎小管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)情況。2、構(gòu)建靶向PROX1的siRNA慢病毒表達(dá)載體及PROX1的慢病毒表達(dá)載體并進(jìn)行慢病毒的包裝以用于后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究。3、用靶向PROX1的siRNA重組慢病毒感染經(jīng)Western blot證實(shí)高表達(dá)PROX1的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN,降低該細(xì)胞中PROX1的表達(dá)水平,同時(shí)用PROX1重組慢病毒感染經(jīng)Western blot證實(shí)低表達(dá)PROX1的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-0,提高該細(xì)胞中PROX1的表達(dá)水平,進(jìn)而通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,并運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖遷移相關(guān)蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、通過(guò)RT-qPCR、Western blot或免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了人腎癌組織、癌旁腎組織、人腎癌細(xì)胞系及腎小管上皮細(xì)胞系中PROX1 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示,92例新鮮手術(shù)切除標(biāo)本中,腎癌組織PROX1 mRNA的表達(dá)水平較其對(duì)應(yīng)的癌旁腎組織低(p0.001),出乎意料的是,按照病理分期和Fuhrman分級(jí)分層后,T3/4和G3/4腫瘤組織PROX1 mRNA表達(dá)量較T1/2和G1/2腫瘤組織表達(dá)量有增高趨勢(shì),雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；115例石蠟包埋標(biāo)本中,89.7%的癌旁腎組織PROX1蛋白呈高水平表達(dá),僅33.9%的腎癌組織高表達(dá)PROX1蛋白,與PROX1 mRNA表達(dá)特征相似,T3/4和G3/4腫瘤組織PROX1蛋白表達(dá)量分別高于T1/2和G1/2組織,且PROX1蛋白表達(dá)水平與腫瘤核分級(jí)(p0.001)和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.012)呈正相關(guān),PROX1蛋白高表達(dá)患者生存時(shí)間較短,Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型顯示,PROX1可以作為腎癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子；人腎小管上皮細(xì)胞HKC的PROX1蛋白表達(dá)水平較高,腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、769-P及OS-RC-2的PROX1蛋白表達(dá)水平較高,而786-0細(xì)胞幾乎不表達(dá)PROX1蛋白。2、首先采用pLKO.1復(fù)制缺陷性慢病毒載體構(gòu)建靶向PROX1的siRNA重組慢病毒包裝質(zhì)粒,然后采用內(nèi)含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的pWPI慢病毒載體構(gòu)建PROX1重組慢病毒包裝質(zhì)粒,繼而通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組慢病毒包裝質(zhì)粒與重組慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系293,經(jīng)過(guò)濾后獲得重組慢病毒懸液。3、通過(guò)Western blot證實(shí),重組慢病毒vLKO.1-si259和 vLKO.1-sil646感染ACHN細(xì)胞后可顯著敲低內(nèi)源性PROX1的表達(dá)水平,CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示vLKO.1-si259口vLKO.1-si1646感染的ACHN細(xì)胞各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)OD值均低于vLKO.1-siSCR感染的陰性對(duì)照組ACHN細(xì)胞,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)差異愈加明顯,提示PROX1的表達(dá)對(duì)ACHN細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示vLK○.1-si259和vLKO.1-si1646感染的ACHN細(xì)胞克隆形成率(27.3%和21.3%)顯著低于vLK○.1-siSCR感染的陰性對(duì)照組ACHN細(xì)胞(55%)；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示vLKO.1-si259和vLKO.1-si1646感染的ACHN細(xì)胞24小時(shí)平均遷移距離(537.6μm和533.9μm)短于vLKO.1-siSCR感染的對(duì)照組ACHN細(xì)胞(692.6 μm)。此外,重組慢病毒vWPI.1-PROX1感染786-0細(xì)胞后可顯著增強(qiáng)其PROX1表達(dá)水平,與PROX1 RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反,vWPI.1-PROX1感染的786-0細(xì)胞各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)OD值、克隆形成率(45% vs32%)均高于野生型786-0細(xì)胞,其平均遷移距離(479.6 μm vs 326.9μm)也長(zhǎng)于野生型786-0細(xì)胞。最后利用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),vLKO.1-si259和vLKO.1-si1646感染的ACHN細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增強(qiáng),Vimentin表達(dá)減弱,而vWPI.1-PROX1感染的786-○細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：PROX1在癌旁腎組織中呈高水平表達(dá),而在腎癌組織中表達(dá)水平降低；PROX1蛋白表達(dá)水平與腎癌分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),可作為腎癌的獨(dú)立預(yù)后因子；PROX1能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成,加速細(xì)胞遷移,并能下調(diào)E-cadherin的表達(dá),上調(diào)Vimentin的表達(dá)。本研究從基因水平初步探討了PROX1在腎癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用,有助于人們進(jìn)一步了解腎癌的分子發(fā)病機(jī)制,為腎癌的診斷與治療提供新思路,為PROX1作為腫瘤基因治療的靶點(diǎn)和抗癌藥物的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張思維;陳萬(wàn)青;孔靈芝;李連弟;魯鳳珠;李光琳;孟佳;趙平;;中國(guó)部分市縣1998～2002年惡性腫瘤的發(fā)病與死亡[J];中國(guó)腫瘤;2006年07期

，

本文編號(hào)：2394680