【摘要】：前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是老年男性常見(jiàn)的惡性腫瘤,其死亡率僅次于肺癌。數(shù)據(jù)顯示,2012年新診斷的前列腺癌患者為110萬(wàn),約占新增癌癥病例總數(shù)的15%,其中四期PCa患者5年生存率僅為20%,10年生存率低于10%。雖然我國(guó)PCa的發(fā)病率明顯低于歐美國(guó)家,但近年來(lái)隨著人口老齡化、生活環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的改變等,我國(guó)PCa發(fā)病率增長(zhǎng)迅速,且中晚期患者的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于國(guó)外,惡性程度高,預(yù)后差。預(yù)計(jì)2020年前后,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率可能會(huì)超過(guò)60-70/10萬(wàn)。前列腺癌已成為臨床關(guān)注的男性惡性疾病之一。 PCa作為激素依賴性腫瘤,去勢(shì)治療是首選標(biāo)準(zhǔn)方案,約80%的前列腺癌對(duì)去勢(shì)治療敏感。然而絕大多數(shù)PCa患者經(jīng)去勢(shì)治療1-2年后,腫瘤復(fù)發(fā),成為激素難治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer, HRPC),抵抗內(nèi)分泌治療,抗凋亡能力強(qiáng),伴隨腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,死亡率高,預(yù)后差。由于HRPC的發(fā)展和演變是復(fù)雜的多因素、多信號(hào)通路參與的過(guò)程,目前的研究主要側(cè)重于兩方面,一是HRPC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,二是新靶點(diǎn)的鑒定及其干預(yù)藥物。我們利用生物信息學(xué)技術(shù),通過(guò)分析癌癥和腫瘤基因圖譜(Cancer Genome Atlas, TCGA)計(jì)劃所提供的大規(guī)�；蚪M測(cè)序數(shù)據(jù),繪制了人前列腺癌的基因組變異圖譜,并進(jìn)行系統(tǒng)分析,確定與HRPC的分期、侵襲轉(zhuǎn)移、藥物耐受等惡性表型密切相關(guān)的基因,篩選出AGR2為候選靶基因之一。由于TCGA的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)主要來(lái)自歐美人群,我們又利用中國(guó)漢族人群PCa患者的臨床樣本進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)AGR2與中國(guó)漢族人群PCa患者的惡性表型密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),降低AGR2在PCa細(xì)胞中的表達(dá),可通過(guò)DNA損傷應(yīng)答機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。同時(shí)發(fā)現(xiàn)具有拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制活性的天然聯(lián)芐化合物,可通過(guò)DNA損傷應(yīng)答信號(hào)誘導(dǎo)PCa細(xì)胞衰老,而在DNA損傷程度較強(qiáng)時(shí)誘導(dǎo)激素非依賴PCa細(xì)胞凋亡。另外還發(fā)現(xiàn),聯(lián)芐化合物可通過(guò)抑制雄激素受體的表達(dá)和功能誘導(dǎo)激素依賴性PCa細(xì)胞凋亡。 第一部分基于前列腺癌基因組圖譜的AGR2功能分析與AGR2缺乏介導(dǎo)的DNA損傷誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞衰老的機(jī)制作用 目前已知的癌癥有200多種,但是所有腫瘤在特殊類別(分型)或發(fā)展的不同分期方面都發(fā)現(xiàn)有基因組的特異變化,而正是基因組的改變導(dǎo)致了細(xì)胞分化、發(fā)育和生長(zhǎng)通路的異常,從而引發(fā)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的失控。本論文通過(guò)分析癌癥和腫瘤基因圖譜(Cancer Genome Atlas,TCGA)計(jì)劃所提供的大規(guī)�；蚪M測(cè)序數(shù)據(jù),繪制了人類前列腺癌的基因組變異圖譜,并進(jìn)行系統(tǒng)分析,旨在找到所有癌基因和抑癌基因的微小變異,分析其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的變化趨勢(shì)及可能的作用,確定能夠驅(qū)動(dòng)PCa發(fā)生的潛在drivers或治療靶點(diǎn),以期發(fā)現(xiàn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展和治療的新策略。 前梯度同源蛋白2(Anterior gradient protein2homolog, AGR2)是本課題組通過(guò)前列腺癌基因組圖譜分析得到的候選靶基因之一�，F(xiàn)已報(bào)道多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展伴隨著AGR2表達(dá)的上調(diào),包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌等等。在正常的前列腺組織中,AGR2受雄激素誘導(dǎo)表達(dá),但是對(duì)前列腺癌樣品的顯微切割分析表明AGR2的mRNA和蛋白水平都較臨近的良性組織有顯著的升高。最近有報(bào)道指出,在前列腺癌患者的尿液中檢測(cè)到高水平的AGR2,因此AGR2有望作為前列腺癌的尿檢標(biāo)志物。到目前為止,尚未報(bào)道過(guò)漢族人群前列腺癌組織中AGR2蛋白的表達(dá)情況及作用機(jī)制。本課題組對(duì)漢族人群前列腺組織AGR2蛋白的表達(dá)做了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在漢族人群前列腺癌組織中AGR2的表達(dá)水平顯著高于良性組織,同時(shí)在前列腺癌細(xì)胞系中也觀察到AGR2的表達(dá)明顯高于前列腺正常上皮細(xì)胞,并首次發(fā)現(xiàn)和提出抑制前列腺癌細(xì)胞中AGR2的表達(dá)可導(dǎo)致顯著性細(xì)胞衰老。通過(guò)詳細(xì)剖析AGR2基因在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,表明AGR2在前列腺癌檢測(cè)和治療中具有潛在價(jià)值。 一、前列腺癌基因組圖譜的繪制 1.前列腺癌轉(zhuǎn)錄組嚴(yán)重失調(diào)。通過(guò)對(duì)256例前列腺癌組織以及45例前列腺癌旁正常組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing, RNASeq)數(shù)據(jù)分析,癌組織中24%以上的基因較正常組織有顯著性上調(diào)或下調(diào),其中蛋白編碼基因(Protein-coding genes, PCGene)失調(diào)率為28.53%,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)失調(diào)率為27.64%,假基因(Pseudogene)失調(diào)率為16.61%。 2.前列腺癌體細(xì)胞基因組中存在DNA序列拷貝數(shù)的畸變。通過(guò)對(duì)258例前列腺癌樣本以及相匹配的正常對(duì)照組織的高分辨率單核苷酸多態(tài)性基因分型芯片(Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array6.0,SNP6.0)分析,共找到了2448個(gè)拷貝數(shù)異常的基因,包括961個(gè)PCGene,808個(gè)lncRNA和679個(gè)Psuedogeneo 3.前列腺癌表觀遺傳學(xué)分析。通過(guò)對(duì)252例前列腺癌組織以及49例前列腺癌旁正常組織的全基因組甲基化芯片(Illumina Infinium HumanMethylation450BeadChip)分析,得到了2617個(gè)前列腺癌特異性過(guò)甲基化基因,提示前列腺癌中存在全基因組甲基化失衡。對(duì)259例前列腺癌組織以及50例前列腺癌旁正常組織的：miRNA深度測(cè)序(miRNASeq)數(shù)據(jù)分析顯示,前列腺癌組織中36.90%的miRNA較正常組織有顯著性上調(diào)或下調(diào)。 二、基于圖譜信息和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)AGR2的表達(dá)和功能的分析 1.AGR2基因在PCa組織中表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)對(duì)前列腺癌INASeq數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)AGR2基因在前列腺組織中有較高的基礎(chǔ)豐度,而且在PCa組織中的表達(dá)豐度上調(diào)非常顯著。而DNA序列拷貝數(shù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,AGR2的拷貝數(shù)在正常組織和癌組織中并無(wú)顯著差異。另外,全基因組甲基化芯片分析結(jié)果顯示,AGR2在腫瘤組織中并無(wú)異常甲基化修飾。這些結(jié)果表明,AGR2在PCa中的高表達(dá)并非拷貝數(shù)增加或甲基化異常,而mRNA穩(wěn)定性增加、或在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增強(qiáng)等機(jī)制可能參與其調(diào)控,尚需進(jìn)行研究。 2.AGR2在中國(guó)漢族人群PCa患者的組織中表達(dá)顯著上調(diào)。由于TCGA的數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道主要來(lái)自歐美國(guó)家人群,而PCa的發(fā)生與種族有關(guān)。到目前為止,中國(guó)漢族人群前列腺癌患者組織中AGR2蛋白的表達(dá)情況及功能尚未報(bào)道。本課題通過(guò)免疫組化技術(shù)分析漢族人群良性前列腺增生、前列腺癌組織中AGR2蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,漢族人群前列腺癌組織中AGR2的表達(dá)水平顯著高于良性組織,與歐美人群的表達(dá)趨勢(shì)一致。Western blotting結(jié)果顯示,AGR2在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于前列腺非惡性上皮細(xì)胞。因此,上述結(jié)果顯示,AGR2基因在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控、生物學(xué)功能都有待進(jìn)一步研究,以闡明其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展和治療中的潛在價(jià)值。 3.AGR2在前列腺癌中的功能�；赗NASeq數(shù)據(jù)組對(duì)AGR2的連坐效應(yīng)相關(guān)分析(Guilt-by-Association,GBA)提示,AGR2在前列腺癌中的功能可能與細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞粘附等相關(guān)。文獻(xiàn)已有報(bào)道,AGR2與細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等有關(guān),但機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。 三、DNA損傷應(yīng)答參與AGR2介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞衰老的機(jī)制研究 1.下調(diào)AGR2抑制PCa細(xì)胞增殖。上述結(jié)果表明,AGR2在中國(guó)漢族人群PCa組織、細(xì)胞系中高表達(dá),我們首先在AGR2表達(dá)相對(duì)較高的PC3細(xì)胞中通過(guò)RNAi下調(diào)AGR2的表達(dá),觀察細(xì)胞表型的變化。MTT結(jié)果顯示,下調(diào)AGR2后,顯著抑制PC3細(xì)胞的增殖。相反,在AGR2表達(dá)相對(duì)較低的LNCaP和DU145細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AGR2的表達(dá)質(zhì)粒,細(xì)胞的存活數(shù)顯著增加。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種PCa細(xì)胞中下調(diào)AGR2的表達(dá)后,BrdU的摻入顯著降低,表明AGR2促進(jìn)細(xì)胞增殖。Western blotting結(jié)果顯示,下調(diào)AGR2后,抑制PCa細(xì)胞增殖、存活信號(hào)通路,如p-Akt表達(dá)水平下降,但Akt總蛋白的表達(dá)水平并無(wú)變化；p-ERK的水平略有下調(diào),對(duì)總ERK蛋白的表達(dá)水平無(wú)影響。 2.下調(diào)AGR2阻滯PCa細(xì)胞周期進(jìn)程。免疫組化結(jié)果顯示,PCa組織中AGR2的高表達(dá)伴隨著周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)上調(diào),而周期抑制因子p16、pRb在良性前列腺增生、前列腺內(nèi)皮肉瘤中表達(dá)升高,但在PCa組織中表達(dá)顯著下調(diào)。IINAi結(jié)果顯示,下調(diào)AGR2的表達(dá),PCa細(xì)胞顯著阻滯于G1期。 3.抑制AGR2的表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞衰老。利用siRNA抑制AGR2的表達(dá)后,PCa細(xì)胞扁平脹大呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞衰老形態(tài)。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence associated P-galactosidase,SA-β-Gal)染色和衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集灶(Senescence-associated heterochromatin foci,SHAF)分析進(jìn)一步確認(rèn)抑制AGR2表達(dá)可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞衰老。 4.干擾AGR2的表達(dá)上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子從而引起細(xì)胞衰老。在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP(表達(dá)野生型p53)和PC3(p53無(wú))中抑制AGR2表達(dá)后,p21以p53非依賴的方式表達(dá)上調(diào),Cyclin D1、pRb的表達(dá)顯著下降,p16的表達(dá)有所增加。RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)AGR2后誘導(dǎo)的LNCaP和PC3細(xì)胞衰老過(guò)程依賴于p21的激活。而在DU145細(xì)胞中(表達(dá)野生型PTEN,無(wú)功能性p53),下調(diào)AGR2的表達(dá),使PTEN的表達(dá)有所增加,顯著誘導(dǎo)p27的表達(dá),而p16的表達(dá)有所增加,p21的變化不顯著。進(jìn)一步分析證實(shí)下調(diào)AGR2誘導(dǎo)的DU145細(xì)胞衰老則部分依賴于p27信號(hào)通路。 5.抑制AGR2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老伴隨DNA損傷。由于DNA損傷應(yīng)答信號(hào)是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的主要機(jī)制之一,我們利用熒光抗體標(biāo)記、流式分析DNA損傷的標(biāo)志蛋白yH2AX的變化,結(jié)果顯示,下調(diào)AGR2表達(dá)后,LNCaP和PC3細(xì)胞中yH2AX的表達(dá)顯著增加,DU145細(xì)胞中yH2AX表達(dá)上調(diào),但較LNCaP和PC3細(xì)胞弱,表明,DNA損傷參與AGR2下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過(guò)程,但機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。 第二部分DNA損傷應(yīng)答抑制DNA損傷修復(fù)引起細(xì)胞衰老或凋亡的機(jī)制研究 由于下調(diào)癌基因AGR2的表達(dá),可誘導(dǎo)PCa細(xì)胞衰老,使我們進(jìn)一步分析誘導(dǎo)細(xì)胞衰老作為PCa治療的可能性。由于衰老細(xì)胞缺乏增殖能力,這無(wú)疑有利于腫瘤的治療,因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老(Prosenescence therapy)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),化療(如DNA損傷藥物順鉑、多柔比星等)后,腫瘤組織中除了凋亡細(xì)胞外,也產(chǎn)生衰老細(xì)胞,稱為TIS (Therapy-Induced Senescence)。 DNA損傷藥物是目前研究較多的促進(jìn)細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)劑。藥物誘導(dǎo)的DNA損傷類型有多種,例如喜樹堿和依托泊苷可以通過(guò)捕獲拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA復(fù)合物觸發(fā)DNA單鏈或雙鏈的斷裂；順鉑可與DNA結(jié)合,產(chǎn)生鏈內(nèi)交聯(lián)與鏈間交聯(lián),從而破壞DNA的功能；環(huán)磷酰胺可使DNA分子中的鳥嘌呤N7烷化后除去,留下缺失堿基后的空隙,造成移碼突變。并且一種DNA損傷劑往往可以同時(shí)引起幾種類型的損傷,其損傷效應(yīng)的大小和類型與劑量及細(xì)胞所處的周期狀態(tài)有關(guān)。 對(duì)于不同的DNA損傷病變,特異的DNA損傷檢控點(diǎn)通路將被激活。DNA損傷檢控點(diǎn)通路是由一系列檢控蛋白構(gòu)成的復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),在細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、DNA復(fù)制和染色體分離中發(fā)揮重要的作用,并對(duì)DNA損傷做出及時(shí)應(yīng)答啟動(dòng)修復(fù),以防止基因突變和遺傳不穩(wěn)定的發(fā)生。研究表明,毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白(ataxia-telangiectasia mutated, ATM)、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變Rad3相關(guān)蛋白(ATM and Rad3-related,ATR)在DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng)中起到了至關(guān)重要的作用。ATM主要應(yīng)對(duì)雙鏈斷裂,當(dāng)DNA雙鏈?zhǔn)軗p時(shí),ATM發(fā)生自磷酸化并激活一系列下游分子,包括Chk2, BRCA1和NBS1等,在這些因子的共同作用下,細(xì)胞的應(yīng)激系統(tǒng)被啟動(dòng),產(chǎn)生周期阻滯,并進(jìn)行DNA修復(fù),細(xì)胞衰老和凋亡也可能隨之發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的DNA復(fù)制壓力時(shí)ATR將被激活,并磷酸化Chkl,激活下游Cdc25分子,抑制CDK1/Cyclin B復(fù)合物活性使細(xì)胞周期阻滯,進(jìn)而啟動(dòng)DNA修復(fù)程序。DNA雙鏈斷裂主要有兩種修復(fù)機(jī)制,同源重組(homologous recombination,HR)和DNA末端鏈接(nonhomologous end joining,NHEJ)。HR修復(fù)是利用細(xì)胞內(nèi)的染色體兩兩對(duì)應(yīng)的特性,若其中一條染色體上的DNA發(fā)生雙股斷裂,則另一條染色體上對(duì)應(yīng)的DNA序列即可當(dāng)作修復(fù)的模版來(lái)回復(fù)斷裂前的序列；NHEJ修復(fù)不需要任何模版,修復(fù)蛋白Ku70/86可以直接將雙股裂斷的末端彼此拉近,再借由DNA黏合酶的幫助下,將斷裂的兩股重新接合。DNA損傷檢控點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能和DNA修復(fù)機(jī)制異常,DNA損傷不能及時(shí)得到修復(fù),細(xì)胞將會(huì)走向衰老或凋亡。本課題組研究發(fā)現(xiàn),雙聯(lián)芐化合物RD,能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷,抑制DNA損傷修復(fù),最終誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞走向衰老或凋亡。 一、低劑量片葉苔素D誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生p21依賴的細(xì)胞衰老 1.低劑量RD誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞衰老。0.5μmol/L的RD處理細(xì)胞10天后,前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145和LNCaP均出現(xiàn)細(xì)胞克隆能力顯著下降、周期阻滯、細(xì)胞形態(tài)扁平脹大等細(xì)胞衰老特征。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色和衰老相關(guān)分泌表型(enescence-associated secretory phenotype,SASP)分析證實(shí),RD誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞衰老。DNA損傷標(biāo)志蛋白yH2AX的免疫熒光結(jié)果顯示,低劑量的P.D誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的DNA損傷,Western-blotting結(jié)果顯示,DNA損傷檢控點(diǎn)蛋白Chkl/2和損傷修復(fù)相關(guān)蛋白Ku70/86與p-BRCAl表達(dá)受到抑制。以上結(jié)果提示,低劑量RD可能通過(guò)誘導(dǎo)引起前列腺癌細(xì)胞DNA損傷并抑制損傷修復(fù),從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。 2.低劑量RD誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老依賴于p21的激活。Western-blotting和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,RD處理后,前列腺癌細(xì)胞p21的表達(dá)顯著增高。利用siRNA特異性的降低p21的表達(dá),可顯著逆轉(zhuǎn)RD誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。 3.RD誘導(dǎo)荷瘤動(dòng)物體內(nèi)癌細(xì)胞衰老。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明,RD能顯著抑制荷瘤動(dòng)物體內(nèi)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色和衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集灶分析表明,RD處理后,裸鼠體內(nèi)癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞衰老。DNA損傷標(biāo)志蛋白γH2AX的免疫組化結(jié)果顯示,RD誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNA損傷。免疫組化結(jié)果顯示p21在RD處理組的裸鼠癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào),提示RD誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)癌細(xì)胞衰老的機(jī)制可能與p21的激活有關(guān)。 二、片葉苔素D誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷并抑制損傷修復(fù) 1.片葉苔素D誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷,激活損傷應(yīng)答程序。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示,終濃度10μmol/L的RD處理細(xì)胞24h后,前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期被明顯阻滯在G2/M期,并伴隨大量的細(xì)胞凋亡。yH2AX焦點(diǎn)分析、微核試驗(yàn)和彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí),10μmol/L的RD誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC3產(chǎn)生明顯的DNA損傷。時(shí)相分析顯示,DNA損傷檢控點(diǎn)通路ATM/Chk2和ATR/Chkl在處理1h后顯著激活。ATM/ATR抑制劑處理細(xì)胞后,能部分逆轉(zhuǎn)片RD導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制。 2.片葉苔素D顯著抑制DNA損傷修復(fù)。Western-blotting結(jié)果顯示10μmol/L的RD顯著抑制DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白BRCA1的表達(dá)；DNA修復(fù)活性檢測(cè)表明,RD顯著抑制了HR和NHEJ修復(fù)系統(tǒng)功能,并抑制了DNA修復(fù)酶Ku70/86的表達(dá)和活性。基因芯片結(jié)果分析顯示,受RD影響的基因主要集中在細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期,DNA損傷和修復(fù),以及凋亡相關(guān)通路。 3.片葉苔素D誘導(dǎo)荷瘤動(dòng)物癌細(xì)胞DNA損傷。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明,RD能顯著抑制荷瘤動(dòng)物體內(nèi)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Western-blotting和免疫熒光結(jié)果顯示,RD能夠改裸鼠體內(nèi)癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞凋亡相關(guān)通路基因的表達(dá)。其中DNA損傷標(biāo)志蛋白yH2AX的顯著上調(diào)表明,RD處理的裸鼠癌細(xì)胞存在明顯的DNA損傷。 第三部分雙聯(lián)芐化合物抑制雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞增殖機(jī)制研究 隨著腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤分子生物學(xué)研究的發(fā)展,人類對(duì)癌癥的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入,在腫瘤治療方面取得了很多振奮人心的成果。例如：小分子化合物多西紫杉醇對(duì)去勢(shì)治療失敗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者顯示出明顯生存優(yōu)勢(shì),極大的改善了晚期前列腺癌患者的生存期。然而過(guò)半的前列腺癌患者存在藥物不敏感及耐藥現(xiàn)象,因而亟待研發(fā)新的抗腫瘤藥物。雙聯(lián)芐(Bisbibenzyls)是從苔蘚植物分離提純得到的一類大環(huán)多酚類化合物,這類化合物結(jié)構(gòu)新穎、多變,聯(lián)芐之間具有連接方式和取代基團(tuán)多樣化的特點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)這種化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗真菌等多種生物活性,具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力和前景。本課題組基于雙聯(lián)芐類化合物片葉苔素C(Riccardin C)、地錢素M(Marchantin M,MM)和片葉苔素D(Riccardin D)對(duì)雄激素依賴性細(xì)胞系LNCaP的增殖抑制作用,研究了其具體機(jī)制。 近年來(lái)研究顯示,P13K信號(hào)途徑對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生起重要作用,而AR信號(hào)通路則是激素依賴性前列腺癌增殖的關(guān)鍵途徑。雄激素受體(Androgenreceptor,AR)是一種核受體型轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)雄激素與AR結(jié)合后,會(huì)引起AR構(gòu)象的改變,使AR與熱休克蛋白90(HSP-90)解離,隨即活化而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),并形成同源二聚體與雄激素受體應(yīng)答元件(AREs)結(jié)合,誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此,有效抑制雄激素依賴的前列腺癌中AR的表達(dá)和功能一直是倍受關(guān)注的熱點(diǎn)話題。本課題研究結(jié)果顯示,雙聯(lián)芐化合物片葉苔素C(Riccardin C)、MM和RD能顯著抑制雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞LNCaP的增殖能力。由于AR是LNCaP細(xì)胞增殖存活的關(guān)鍵調(diào)控因子,我們研究了雙聯(lián)芐化合物對(duì)AR表達(dá)和功能的影響以及與LNCaP增殖抑制之間的關(guān)系。 一、雙聯(lián)芐化合物抑制AR的表達(dá)和功能促進(jìn)LNCaP細(xì)胞凋亡 1.RC、MM和RD抑制雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞LNCaP惡性增殖。RC、MM和RD將LNCaP細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,并伴隨著p53和p21蛋白水平的增高；Western-blotting結(jié)果顯示,雙聯(lián)芐化合物處理后Bax/Bc12蛋白比例和PARP剪切形式明顯增加,表明LNCaP細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凋亡。 2. LNCaP細(xì)胞凋亡伴隨著AR表達(dá)和活性的降低。熒光素酶報(bào)告基因分析和Western-blotting結(jié)果顯示,RC、MM和RD明顯抑制LNCaP細(xì)胞AR的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。當(dāng)雙聯(lián)芐化合物處理后,LNCaP細(xì)胞中PSA啟動(dòng)子活性降低,免疫共沉淀(co-IP)結(jié)果顯示AR與SRC-1結(jié)合減弱,提示AR的功能受到明顯抑制。 3.雙聯(lián)芐化合物抑制蛋白酶體活性誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞自噬。RC、MM或RD處理細(xì)胞24h后,蛋白酶體活性顯著下降,Western-blotting和co-IP結(jié)果顯示,泛素化AR在細(xì)胞內(nèi)蓄積。LC3蛋白表達(dá)及免疫熒光分析證實(shí)雙聯(lián)芐化合物引起LNCaP細(xì)胞自噬,AR、 LC3及Ub的公定位分析提示,泛素化AR的降解與細(xì)胞自噬有關(guān)。 第四部分結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn) 一、結(jié)論 1.前列腺癌組織基因組較正常組織出現(xiàn)了明顯的變異。 2.AGR2在前列腺組織中高表達(dá),抑制AGR2誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞衰老。 4.片葉苔素D誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷并抑制損傷修復(fù),引起前列腺癌細(xì)胞衰老或凋亡。 5.雙聯(lián)芐化合物能夠抑制激素依賴的前列腺癌細(xì)胞AR的表達(dá)和功能,從而抑制其惡性增殖。 二、創(chuàng)新點(diǎn) 1.利用大樣本、多平臺(tái)、高通量的基因組學(xué)手段,細(xì)致繪制了前列腺癌基因圖譜。為研究前列腺癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,探索新的診斷和治療方法,提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。 2.首次報(bào)道AGR2在漢族人群前列腺癌患者中的表達(dá)分布,首次發(fā)現(xiàn)和提出在前列腺癌細(xì)胞中抑制AGR2的表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞衰老。 2.首次報(bào)道雙聯(lián)芐化合物抑制AR的表達(dá)和功能,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于LNCaP細(xì)胞表達(dá)的是突變型AR,雙聯(lián)芐化合物的這種抑制作用將有益于AR持續(xù)活化的前列腺癌的治療。 3.首次報(bào)道片葉苔素D可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷并抑制損傷修復(fù),從而導(dǎo)致癌細(xì)胞衰老或凋亡。由于DNA損傷修復(fù)機(jī)制是大多數(shù)DNA損傷類化療藥物敏感性的關(guān)鍵因素之一,片葉苔素D不僅能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷,并能進(jìn)一步抑制損傷的修復(fù),這些特點(diǎn)將使片葉苔素D成為很有潛力和競(jìng)爭(zhēng)力的抗腫瘤候選藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2384113