【摘要】：目的:本研究使用胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的C結(jié)構(gòu)域多肽修飾殼聚糖(CS)制備生物活性CS-IGF-1C水凝膠,評(píng)價(jià)水凝膠的細(xì)胞相容性及其對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)體外增殖、抗凋亡和促血管生成等生物學(xué)特性的影響。建立小鼠急性腎臟損傷(AKI)模型,利用水凝膠負(fù)載ADSCs移植入受損腎臟,評(píng)價(jià)CS-IGF-1C能否改善ADSCs在體內(nèi)存活并提高其多向分化能力,探討其增強(qiáng)細(xì)胞治療效果的機(jī)制,為使用組織工程學(xué)手段促進(jìn)腎臟修復(fù)提供新的理論依據(jù)。方法:1.從表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)-螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc)雙融合蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪分離ADSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力,使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞學(xué)(FCM)及生物發(fā)光成像(BLI)證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)基因特性,鑒定細(xì)胞表型并描述其多向分化潛能。2.合成IGF-1的C結(jié)構(gòu)域(IGF-1C)多肽,并使用多肽修飾CS獲得CS-IGF-1C,使用傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析CS-IGF-1C的化學(xué)結(jié)構(gòu)、平行板流變儀檢測(cè)水凝膠的流變學(xué)特性、掃描電鏡(SEM)觀察CS-IGF-1材料的形態(tài),并評(píng)價(jià)CS-IGF-1C的成膠性能。在涂布水凝膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)ADSCs,觀察細(xì)胞形態(tài)并使用活死染色評(píng)價(jià)水凝膠的細(xì)胞相容性。3.將ADSCs培養(yǎng)于涂布水凝膠的培養(yǎng)皿中,使用CCK-8法和BLI評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力,實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中增殖相關(guān)基因(HGF、IGF-1和EGF)的表達(dá)。對(duì)ADSCs進(jìn)行H2O2刺激誘導(dǎo)氧化損傷,使用BLI和Annexin V/PI染色評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因(Bax/Bad、Caspase-9/-3和Fas/Fasl)的表達(dá)。此外,利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ADSCs血管新生基因(Ang-1/-2、VEGF-A、HIF-1α、PLGF、PDGF-BB、b-FGF和CCL5)的表達(dá)。4.構(gòu)建FVB小鼠急性腎臟缺血損傷模型,根據(jù)治療情況分組:sham、PBS、CS、ADSCs、ADSCs/CS、ADSCs/CS-IGF-1C。利用BLI評(píng)價(jià)移植的ADSCs體內(nèi)存活,高碘酸-希夫(PAS)染色及檢測(cè)血清肌酐和尿素氮(BUN)的水平評(píng)價(jià)腎臟組織學(xué)和功能學(xué)恢復(fù),損傷后14天使用GFP/Cytokeratin和GFP/CD31雙染評(píng)價(jià)水凝膠對(duì)于ADSCs向腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響。PCNA染色評(píng)價(jià)損傷后3天腎臟內(nèi)細(xì)胞增殖及損傷后28天水凝膠注射部位和鄰近區(qū)域細(xì)胞增殖情況。損傷后3天TUNEL和Bax染色評(píng)價(jià)腎臟內(nèi)細(xì)胞凋亡。損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CD31和α-SMA染色評(píng)價(jià)血管新生,損傷后14天CD31染色檢測(cè)水凝膠注射部位毛細(xì)血管長(zhǎng)入情況。對(duì)C57BL/6J背景VEGF-R2轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)AKI,分組為sham、PBS、CS、ADSCs、ADSCs/CS、ADSCs/CS-IGF-1C,損傷后BLI實(shí)時(shí)檢測(cè)VEGF-R2表達(dá),探討血管新生的機(jī)制。損傷后2個(gè)月Masson、天狼星紅及IV型膠原染色評(píng)價(jià)膠原沉積,α-SMA染色評(píng)價(jià)肌成纖維細(xì)胞浸潤(rùn),利用免疫染色評(píng)價(jià)腎臟中MMP-2的表達(dá)。使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)腎臟組織中促纖維化基因(TGF-β、Col1A1和α-SMA)的表達(dá)。結(jié)果:1.體外培養(yǎng)的ADSCs具有較強(qiáng)的增殖能力并穩(wěn)定表達(dá)GFP,體外BLI分析顯示細(xì)胞數(shù)量和生物發(fā)光強(qiáng)度存在正相關(guān)(R2=0.99)。ADSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD105),不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記物(CD31、CD34、CD45),且能被誘導(dǎo)向脂肪、骨和軟骨細(xì)胞分化。2.FT-IR分析證實(shí)IGF-1C多肽成功連接到CS上,流變學(xué)檢測(cè)顯示CS和CS-IGF-1C兩種水凝膠的成膠溫度為35°C-36°C,SEM結(jié)果顯示兩種材料均具有均一的相互聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu),孔徑約為50μm-100μm。此外,水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性。3.體外二維條件下培養(yǎng)ADSCs,CS-IGF-1C能促進(jìn)細(xì)胞增殖并顯著上調(diào)增殖相關(guān)基因的表達(dá),能對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并下調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá),還能上調(diào)ADSCs中血管新生相關(guān)基因的表達(dá)。4.體內(nèi)研究中,CS-IGF-1C水凝膠能顯著增加移植的ADSCs在腎內(nèi)駐留,并且有利于ADSCs向腎小管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,從而促進(jìn)腎臟組織學(xué)和功能學(xué)修復(fù)。CS-IGF-1C聯(lián)合ADSCs移植能在損傷后早期,增強(qiáng)腎臟細(xì)胞增殖、抑制腎臟細(xì)胞凋亡,并增加腎臟血管新生。BLI分析顯示,CS-IGF-1C/ADSCs組VEGF-R2的表達(dá)顯著高于其他組。此外,ADSCs能夠與水凝膠的微環(huán)境相互作用,CS-IGF-1C/ADSCs組水凝膠內(nèi)血管長(zhǎng)入和增殖細(xì)胞的數(shù)量顯著高于其他組。損傷后2個(gè)月評(píng)價(jià)腎臟慢性纖維化,CS-IGF-1C/ADSCs治療能顯著減少腎臟間質(zhì)內(nèi)膠原沉積、肌成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)以及MMP-2表達(dá),并明顯下調(diào)腎臟纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)論:1.我們開(kāi)發(fā)出一種可注射的溫度敏感性的生物模擬CS-IGF-1C水凝膠;2.CS-IGF-1C水凝膠具有較好的生物相容性,能在體外發(fā)揮促進(jìn)ADSCs增殖、抑制凋亡、促進(jìn)血管新生的作用;3.CS-IGF-1C水凝膠聯(lián)合ADSCs注射到受損腎臟,可以改善ADSCs體內(nèi)存活,增強(qiáng)細(xì)胞多向分化能力,加快腎臟修復(fù);4.CS-IGF-1C水凝膠聯(lián)合ADSCs治療腎損傷的機(jī)制與兩者相互作用所產(chǎn)生的增加腎臟細(xì)胞增殖、減少凋亡、促進(jìn)腎臟血管新生及抑制腎臟纖維化等效應(yīng)有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692

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1 馮國(guó)偉;IGF-1C結(jié)構(gòu)域修飾的殼聚糖水凝膠增強(qiáng)脂肪干細(xì)胞治療急性腎損傷的療效[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2350558