【摘要】：研究背景:造影劑腎病(contrast-induced nephropathy,CIN)的定義為造影劑(contrast media,CM)暴露后48~72h血肌酐絕對值較基礎(chǔ)值升高≥0.5mg/dl或相對升高≥25%,并且排除了其他可能引起腎損害的原因。CIN是冠心病介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)中的常見并發(fā)癥和醫(yī)源性腎損傷,尤其在高風險人群(如糖尿病、慢性心衰、慢性腎損害、老年)中發(fā)病率可高達20%~30%。根據(jù)Mehran報道的CIN風險評分系統(tǒng)進行預(yù)測,評分6,6~10,11~16,16的患者,其CIN的發(fā)生風險分別為7.5%,14%,26%和57%。PCI患者常合并多種慢性疾病,往往是CIN高風險人群。CIN的病程可長可短,病情可輕可重,但至少1%的CIN患者需要透析治療,CIN是CIN高�；颊逷CI術(shù)后仍預(yù)后不良的重要原因之一。CIN的危害不可小覷,CIN的發(fā)生可顯著升高患者遠期發(fā)生慢性腎功能不全的幾率,而慢性腎功能不全又反過來成為心血管不良事件的強預(yù)測因子。盡管為減少CIN的發(fā)生人們做了很多努力,如對擇期PCI治療的患者進行CIN風險評估、水化治療、應(yīng)用新型更安全的造影劑,但高危患者的CIN風險始終存在;迄今為止,還沒有可明確防治CIN的藥物(包括N-乙酰半胱氨酸、碳酸氫鈉、非諾多巴胺、他汀類、肢端缺血預(yù)適應(yīng)、預(yù)防性血透等)。如何有效防治CIN一直是心臟介入醫(yī)生關(guān)心的問題。雖然目前關(guān)于CIN發(fā)生的機制尚未完全清楚,但普遍認為造影劑對腎小管供氧平衡的破壞和直接細胞毒性是其損傷的主要機制。(1)供氧減少:造影劑可引起腎內(nèi)血管收縮,腎組織缺血缺氧,尤其是亨氏袢(Henle's loop)升支粗段(medullary thick ascending limb,mTAL)所在的外層髓質(zhì)最容易受影響,該段的主動重吸收功能耗氧量大;而在合并有慢性腎功能減退的高危CIN患者中,組織局部在生理狀態(tài)下對微循環(huán)的擴張發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用的一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素(prostanoids,PGs)和腺苷合成卻減少,使腎內(nèi)血管收縮呈持續(xù)狀態(tài)。(2)耗氧增加:造影劑的滲透性利尿作用可加重mTAL的重吸收負荷,耗氧量增多,加重缺氧和線粒體受損。(3)直接細胞毒性:造影劑可引起上皮細胞皺縮,細胞核突起,內(nèi)皮細胞層斷裂,NO合成減少,凋亡、壞死增多,而腎小管的濃縮作用可增強其毒性,使造影劑粘稠度增加,易引起小管阻塞。最終,造影劑誘導(dǎo)的腎缺氧狀態(tài)觸發(fā)了小管細胞的氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)之間的惡性循環(huán),導(dǎo)致了嚴重的急性腎損傷(acutekidneyinjury,aki);而不斷擴大延伸的持續(xù)性自身炎性反應(yīng)可使aki進展成為慢性腎功能不全。對于腎組織細胞而言,經(jīng)歷了氧化應(yīng)激、造影劑毒性損傷和壞死組織繼發(fā)的無菌性炎性損傷的三重打擊。因此,一個有效的干預(yù)策略應(yīng)該同時具有阻斷氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate,egcg)是從綠茶葉中分離的兒茶素類單體,屬于植物多酚的黃酮類化合物,是茶多酚生物活性的主要成份和主要研究對象,在人群研究中已證實可靜脈或口服給藥,而靜脈給藥是可以急性期干預(yù)的重要條件。大量研究顯示egcg在心血管疾病、肺、肝臟和腎臟疾病中具有抗氧化和抗炎作用,在多種動物急慢性腎病模型中有保護作用,如梗阻性腎病、順鉑腎毒性、腎缺血再灌注損傷、體外循環(huán)誘導(dǎo)的腎損傷、糖尿病腎病、狼瘡性腎病、慢性腎小球腎炎。egcg是否對造影劑腎病有保護作用尚未見報道。本研究通過構(gòu)建大鼠造影劑腎損傷模型,觀察egcg的治療作用,并探討egcg保護作用的分子機制。研究目的:本研究擬構(gòu)建大鼠造影劑腎病模型,觀察egcg對造影劑腎損傷的治療作用,探討egcg抗氧化和抗炎癥的分子信號機制及其作用的關(guān)鍵分子靶點。研究方法:1.首先,構(gòu)建大鼠造影劑腎病模型:用220~250g雄性sprague-dawley(sd)大鼠,通過順序靜脈注射吲哚美辛、nω-硝基-l-精氨酸甲酯鹽酸(nω-nitro-l-argininemethylesterhydrochloride,l-name)、碘普羅胺,建立造影劑腎損傷模型。實驗分為溶劑(vehicle)組、cm組和cm+egcg組(n=5),自動生化分析儀測定血清肌酐(creatinine,cr)、尿素氮(bloodureanitrogen,bun)評估腎功能,觀察該動物模型腎損傷的72h的自然病程,確定反映腎損傷的最佳觀察時間點。2.再通過egcg分組給藥進行效果評價:通過不同濃度(5、10、20mg/kgbodywt)的靜脈egcg干預(yù)觀察對血cr、bun、肌酐清除率(creatinineclearance,crcl)的影響,確定用于后續(xù)實驗的最佳egcg干預(yù)濃度。觀察不同干預(yù)時間點(造模前或后)靜脈egcg干預(yù)對腎功能、腎組織損傷部位和損傷病理評分(he染色),及細胞凋亡(tunel法)的影響,以全面評估egcg對造影劑腎損傷的治療效果。3.接著對egcg的抗氧化作用進行評估,并探討其抗氧化分子機制:用比色法(按試劑盒說明操作)測定腎組織勻漿中氧化應(yīng)激標志物:脂質(zhì)過氧化標志物——丙二醛(malondialdehyde,mda)、抗氧化酶——超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod),評價egcg對造影劑腎損傷的抗氧化作用。用免疫印跡法和免疫熒光染色法測定腎組織血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,ho-1)的蛋白表達水平及分布;提取腎組織核蛋白(按試劑盒說明書操作),用免疫印跡法測定核因子e2-相關(guān)因子2(nuclearfactore2-relatedfactor2,nrf2)的蛋白表達水平,研究egcg對nrf2/ho-1抗氧化信號通路的影響。4.對egcg的抗炎癥作用進行評估,并探討其抗炎癥分子機制:用比色法(按試劑盒說明書操作)測定腎組織勻漿中炎性標志物:白細胞活化標志物——髓過氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)測定前炎癥因子白介素-1β(interleukin-1β,il-1β),評價egcg對造影劑腎損傷的抗炎癥作用。用免疫印跡法和免疫熒光染色法測定腎組織核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nod樣受體)蛋白3(nucleotide-bindingoligomerizationdomainreceptor(nod-likereceptor,nlr)protein3,nlrp3)的蛋白表達水平,探討egcg對nlrp3炎性小體/il-1β自身炎性通路的影響。5.進一步探討egcg抗氧化和抗炎癥保護作用中的關(guān)鍵分子靶點,觀察ho-1抑制劑給藥對egcg造影劑腎損傷保護作用的影響:提前用ho-1抑制劑鋅原卟啉ix(ii)(protoporphyrinixzinc(ii),znpp)或原卟啉錫(tinprotoporphyrinixdichloride,snpp)腹腔注射抑制全身ho-1的活性(znpp/snpp+egcg+cm組),測定腎功能(血cr、bun),觀察ho-1在egcg造影劑腎損傷保護作用中的重要性;測定腎組織氧化應(yīng)激標志物(mda、sod)、炎性標志物(mpo、il-1β)的變化,觀察ho-1抑制對egcg抗氧化和抗炎作用的影響;測定nlrp3表達的變化,觀察ho-1抑制對egcg抗炎性信號通路的影響。6.所有數(shù)據(jù)均采用spss13.0統(tǒng)計軟件進行分析,以均數(shù)±標準誤(mean±sem)表達。計量數(shù)據(jù)經(jīng)kolmogorov-smirnov正態(tài)和levene方差齊性驗證后,多組間比較行one-wayanova和進一步組間bonferroni方差分析。he病理評分組間比較采用非參數(shù)kruskal-wallis分析。以p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.動物模型腎損傷的評估。通過觀察72h血cr、bun的變化評價大鼠造影劑腎損傷模型,發(fā)現(xiàn)造模后24h血cr、bun明顯升高并達到峰值,48h明顯回落,72h逐漸恢復(fù)正常,24h和48h時間點與vehicle組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。選擇24h作為該模型腎損傷觀察的最佳時間點,觀察后續(xù)實驗干預(yù)的療效。2.egcg分組給藥的效果評估。(1)不同濃度的egcg(5、10、20mg/kgbodywt)于造模前15min經(jīng)靜脈給藥觀察對造影劑腎損傷的保護作用,發(fā)現(xiàn)三個egcg濃度組均能改善造影劑腎損傷(p0.05),cr較cm組分別降低28%、58%和60%;bun降低27%、48%和53%;crcl升高0.9倍、2.0倍和1.7倍。選擇10mg/kgbodywt作為egcg的最佳干預(yù)劑量用于后續(xù)的實驗研究。(2)egcg(10mg/kgbodywt)于造模前/后15min經(jīng)靜脈給藥(pre-/post-egcg+cm組),觀察圍損傷期不同時間點干預(yù)的療效,發(fā)現(xiàn)造模后給藥能同等程度地改善造影劑腎損傷的血cr、bun(p0.05)。觀察腎組織he形態(tài)學(xué)病理改變,可見造影劑腎損傷主要定位于外髓質(zhì)層的小管細胞(mtal)。對小管上皮細胞空泡變性/壞死、蛋白管型、間質(zhì)出血(紅細胞)進行半定量病理損傷評分提示造模cm組腎損傷評分顯著升高,而egcg造模前/后給藥均能減少腎小管細胞的損傷程度(p0.05)。tunel染色計數(shù)顯示細胞凋亡在造模cm組明顯增多,egcg造模前/后給藥均能減少腎小管細胞的凋亡程度(p0.05)。3.腎組織氧化應(yīng)激的變化。(1)取腎組織進行勻漿,測量腎組織mda含量和sod的活性,分別反映氧化應(yīng)激中脂質(zhì)過氧化程度和抗氧化酶的水平,發(fā)現(xiàn)造影劑腎損傷后腎組織中的mda含量顯著升高,sod活性顯著降低(p0.05);egcg干預(yù)后能明顯降低mda含量,升高sod活性,改善損傷腎組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)(p0.05)。(2)采用免疫印跡法檢測腎臟nrf2/ho-1抗氧化信號通路在造影劑腎損傷和egcg保護作用中的變化,發(fā)現(xiàn)腎組織ho-1表達在造影劑腎損傷后有所增多(p0.05),egcg干預(yù)使ho-1表達較cm組進一步顯著升高(p0.05);通過ho-1的免疫熒光染色顯示,ho-1主要分布在小管細胞,而非腎小球,造影劑腎損傷及egcg的干預(yù)用藥均可不同程度地升高皮質(zhì)和髓質(zhì)的小管細胞ho-1表達。檢測ho-1的上游抗氧化轉(zhuǎn)錄因子nrf2的表達,發(fā)現(xiàn)造影劑腎損傷后nrf2表達明顯下降(p0.05),egcg干預(yù)可部分上調(diào)nrf2的蛋白表達(p0.05)。4.腎組織炎癥狀態(tài)的變化。(1)檢測腎組織勻漿中白細胞活化的標志物mpo和前炎癥因子il-1β,評估腎臟的炎癥狀態(tài),發(fā)現(xiàn)造影劑腎損傷后腎組織中的mpo活性及il-1β的表達均顯著升高(p0.05);egcg干預(yù)能明顯降低mpo活性及il-1β的表達,改善損傷腎組織的炎性狀態(tài)(P0.05)。(2)進一步檢測NLRP3/IL-lβ炎性小體信號通路在造影劑腎損傷和EGCG保護作用中的變化,發(fā)現(xiàn)造影劑腎損傷后腎組織NLRP3的表達顯著升高(P0.05),EGCG干預(yù)可明顯下調(diào)NLRP3的含量(P0.05)。5.HO-1在EGCG抗氧化和抗炎癥中的重要性。為探討EGCG抗氧化和抗炎癥作用中的關(guān)鍵信號分子,分別采用兩種HO-1的活性抑制劑ZnPP和SnPP進行干預(yù),觀察HO-1受抑制后EGCG對造影劑腎損傷保護作用的變化,發(fā)現(xiàn)ZnPP+EGCG+CM組或SnPP+EGCG+CM組與HO-1未抑制組(CM+EGCG組)比較,血Cr、BUN均明顯升高,HO-1抑制后抵消了EGCG對造影劑腎損傷的保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)ZnPP+EGCG+CM組較HO-1未抑制組腎組織的MDA、MPO、IL-1β水平升高,SOD活性降低,腎組織NLRP3表達增多(P0.05),與CM組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),提示HO-1在EGCG的抗氧化應(yīng)激和抗炎性通路中發(fā)揮了重要性。結(jié)論:EGCG圍損傷期靜脈用藥可減輕造影劑腎損傷。EGCG可通過上調(diào)Nrf2/HO-1抗氧化通路、下調(diào)NLRP3/IL-1β炎癥通路改善腎組織的氧化應(yīng)激和炎癥水平,其中HO-1是EGCG對造影劑腎損傷保護作用的關(guān)鍵分子靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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本文編號：2347011