【摘要】：目的 通過(guò)TGF-β1體外刺激人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)建立腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型,擬(1)通過(guò)PP2Ac過(guò)表達(dá)及小干擾RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞研究PP2Ac在腎小管間質(zhì)纖維化中作用；(2)探討PP2Ac促腎小管間質(zhì)纖維化是否與其介導(dǎo)Smad3中間連接區(qū)去磷酸化有關(guān)。 方法 1、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、TGF-β1刺激組(模型組)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+TGF-β1組(PP2Ac過(guò)表達(dá)和小干擾RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,予5ng/ml TGF-β1刺激干預(yù)24h)。采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)PP2Ac、FN、Col-Ⅰ、α-SMA和E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 2、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞同上,實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、TGF-β1刺激組(模型組)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+TGF-β1組(PP2Ac過(guò)表達(dá)和小干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,TGF-β1刺激1h)。分別提取總蛋白和核蛋白,采用Western blot法檢測(cè)Smad3、Smad3中間連接區(qū)pSmad3-L (Ser204)、pSmad3-L (Ser208)蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 1.RT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示：TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞24h使得PP2Ac表達(dá)上調(diào)的同時(shí),FN、Col-Ⅰ和a-SMA表達(dá)增加,E-cadherin表達(dá)下降,纖維化加重；PP2Ac過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞再予TGF-β1刺激24h后,PP2Ac mRNA及蛋白水平表達(dá)均較TGF-β1刺激組升高,同時(shí)FN、Col-Ⅰ和a-SMA表達(dá)明顯上調(diào),E-cadherin表達(dá)下調(diào),纖維化進(jìn)一步加重；PP2Ac小干擾RNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞再予TGF-β1刺激24h后,較TGF-β1刺激組,PP2Ac的mRNA及蛋白表達(dá)均降低,FN、Col-Ⅰ和a-SMA表達(dá)減少,E-cadherin表達(dá)增高,纖維化緩解。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.予TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞后以Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)PP2Ac、pSmad3-L (Ser204)、pSmad3-L (Ser208)和Smad3的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞1h時(shí)可使PP2Ac的表達(dá)上調(diào)達(dá)到高峰,同時(shí)pSmad3-L (Ser204)在TGF-β1刺激1h左右表達(dá)最高,pSmad3-L (Ser208)在1/2h處達(dá)高峰,但1h處仍表達(dá)明顯,Smad3在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)基本無(wú)變化。故在下面的實(shí)驗(yàn)中選用TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞1h研究PP2Ac促腎間質(zhì)纖維化是否與其介導(dǎo)Smad3中間連接區(qū)去磷酸化有關(guān)。 3.Western blot結(jié)果顯示：TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞1h使得PP2Ac蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí),總蛋白和核蛋白中pSmad3-L (Ser204)和pSmad3-L (Ser208)表達(dá)均增加；HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PP2Ac過(guò)表達(dá)質(zhì)粒再予TGF-β1刺激1h后,較TGF-β1刺激組PP2Ac表達(dá)進(jìn)一步增高,總蛋白和核蛋白中pSmad3-L (Ser204)、pSmad3-L (Ser208)表達(dá)均下降；PP2Ac小干擾RNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞再予TGF-β1刺激1h后,PP2Ac較TGF-β1刺激組表達(dá)減少,同時(shí)總蛋白和核蛋白中pSmad3-L (Ser204)、pSmad3-L (Ser208)蛋白表達(dá)均增加。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.PP2Ac的表達(dá)同F(xiàn)N、Col-I和a-SMA表達(dá)正相關(guān),與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān),提示PP2Ac促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成及腎小管EMT； 2.PP2Ac通過(guò)介導(dǎo)Smad3中間連接區(qū)去磷酸化,即抑制其磷酸化促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。
[Abstract]:Objective to establish a renal interstitial fibrosis cell model by stimulating human renal tubular epithelial cells (HK-2) with TGF- 尾 1 in vitro. (1) to study the role of PP2Ac in renal tubulointerstitial fibrosis by overexpression of PP2Ac and transfection of small interfering RNA plasmid into HK-2 cells. (2) to investigate whether PP2Ac promotes renal tubulointerstitial fibrosis and whether it mediated Smad3 intermediate junction dephosphorylation. Methods 1.Conventionally cultured HK-2 cells were divided into blank control group, TGF- 尾 1-stimulated group (model group), plasmid transfected TGF- 尾 1 group (PP2Ac overexpression and small interfering RNA plasmid transfected HK-2 cells). 5ng/ml TGF- 尾 1 was given for 24 h). The expression levels of PP2Ac,FN,Col- 鈪，

本文編號(hào)：2341682