【摘要】：目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesenchymal stem cells,BM-MSC)來(lái)源exosome對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷(Ⅰschemia Reperfusion Injury,IRⅠ)的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：(1)采用貼壁細(xì)胞分離法分離培養(yǎng)大鼠MSC,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSC表面分子標(biāo)志CD44、CD2、CD34。加入成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液,觀察MSC向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的分化能力,鑒定其多向分化潛能。(2)采用TotalExosome Isolation Reagent結(jié)合超速離心法提取MSC及成纖維細(xì)胞(HFL-1)培養(yǎng)上清中的exosome。透射電鏡下觀察exosome的形態(tài)特點(diǎn)及粒徑大小,并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)exosome表面分子標(biāo)志CD63表達(dá)情況。(3)選取雄性SD大鼠200-250g共30只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組),缺血再灌注損傷組(IR組),MSC處理組(IR+MSC組),MSC來(lái)源exosome處理組(IR+MSC-ex組),成纖維細(xì)胞來(lái)源exosome處理組(IR+F-ex組)。構(gòu)建IR損傷模型,夾閉左側(cè)腎蒂45分鐘,開放左腎動(dòng)脈時(shí)切除右腎,在IR損傷即刻經(jīng)頸動(dòng)脈注入MSC或exosome,IR組給予等量P BS,Sham組僅游離腎蒂后關(guān)腹。(4)術(shù)后48h處死大鼠,留取全血、腎組織福爾馬林固定標(biāo)本及腎組織液氮冰凍標(biāo)本。檢測(cè)血清肌酐和尿素氮水平,HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變并根據(jù)Paller標(biāo)準(zhǔn)行病理評(píng)分,TUNEL染色評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡,腎臟冰凍標(biāo)本提取蛋白質(zhì)及RNA,PCR檢測(cè)炎癥因子IL-1 β、TNF-α表達(dá)水平,Western印跡法檢測(cè)腎組織Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、P-Akt表達(dá)水平。結(jié)果：(1)MSC生長(zhǎng)特征：大鼠骨髓MSC呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)。傳代后,細(xì)胞增殖明顯,高度融合,呈漩渦狀或輻射狀排列。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面高表達(dá)CD29、CD44,低表達(dá)CD34。經(jīng)成骨及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)后,MSC成功分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。(2)Exosome特征：透射電鏡下觀察,提取物為微囊泡樣小體結(jié)構(gòu),圓形或橢圓形,大小均一,直徑在30-60nm。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志CD63表達(dá)陽(yáng)性,證實(shí)提取物為exosome。(3)對(duì)腎功能的作用：再灌注后48小時(shí),MSC組、MSC-ex組血肌酐(分別為147.5±15.89,231.5±30.03)、尿素氮(分別為20.49±5.70,31.36±5.53)與IR組(482±36.87,45.42±2.73)相比均顯著降低；MSC-ex組與F-ex組肌酐(442±41.98)、尿素氮(46.89±3.21)相比,腎功能也顯著改善,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)腎臟病理變化比較：HE染色切片觀察,MSC組、MSC-ex組與IR組相比,病理?yè)p傷明顯減輕,Paller評(píng)分(分別為22.50±6.28,35.17±7.57)與IR組(59.50±8.12)相比顯著降低(均P0.001)；MSC-ex組(35.17±7.57)與F-ex組(58.67±8.59)相比也顯著降低(P0.01)。(5)凋亡比較：TUNEL染色檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,MSC組、MSC-ex組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(分別為5.17±1.17,8.67±1.63)與IR組(13.67±1.86)相比明顯減少(P0.001,P0.01)；MSC-ex組(8.67±1.63)與F-ex組(12.67±1.75)相比也明顯減少(P0.01)。(6)炎癥因子變化：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá),再灌注后48小時(shí),IR組炎癥因子水平明顯升高,與IR組相比,MSC組與MSC-ex組的IL-1β表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05),而TNF-α表達(dá)水平則明顯降低(P0.01)；與F-ex組相比,MSC-ex組IL-1β表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05),TNF-α表達(dá)明顯減少(P0.05)。(7)蛋白水平變化：、Vestern blot檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá),與IR組、F-ex組相比,MSC與MSC-ex組Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)減少(P0.05),而Bcl-2、PI3K、P-Akt蛋白表達(dá)水平則明顯升高(P0.05)。結(jié)論：(1)MSC來(lái)源exosome對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。(2)MSC來(lái)源exosome通過(guò)減輕炎癥反應(yīng),激活P13K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖、抑制凋亡從而發(fā)揮其腎臟保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王曉慶;朱曉健;鄒萍;;間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源微泡的研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2013年01期

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本文編號(hào)：2334301