【摘要】：目的本實驗擬初步研究華蟾素在治療腎癌(RCC)中的治療效果,在體外培養(yǎng)人786-0腎癌細(xì)胞株(Renal cell carcinoma 786-0, RCC 786-0),應(yīng)用華蟾素對該細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù),研究華蟾素對RCC 786-0增殖、凋亡和侵襲力的影響以及對細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的作用。探討華蟾素在RCC治療中的可能性,并進(jìn)一步研究其在抗腫瘤中的作用機(jī)制。方法取人RCC 786-0,在適宜的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)；待細(xì)胞生長穩(wěn)定后將細(xì)胞株進(jìn)行分組,設(shè)置若干組分別應(yīng)用不同濃度的華蟾素作用于RCC786-0,采用CCK8法觀察各組細(xì)胞增殖的情況,篩選出最佳抑制濃度和時間點；根據(jù)結(jié)果分設(shè)三組：空白組、最佳抑制濃度組、陽性對照組(5-氟尿嘧啶),分別作用RCC 786-0,在最佳抑制時間后用流式細(xì)胞儀檢測各組RCC細(xì)胞凋亡及周期的變化；用Transwell法檢測各組RCC細(xì)胞侵襲力的變化情況；篩選促凋亡相關(guān)基因Bax和caspase-3以及抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2作為檢測指標(biāo),分別采用QPCR和Western blot技術(shù)在RNA和蛋白水平對其表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果華蟾素在0.1mg/ml劑量下作用24h,抑制RCC 786-0活性達(dá)到最佳(p0.01)。華蟾素組G0/G1期細(xì)胞所占比例較對照組增加,S期無顯著變化,G2/M期細(xì)胞比例較對照組減少。提示華蟾素能夠?qū)CC細(xì)胞阻滯于GO/G1期,抑制細(xì)胞DNA復(fù)制。濃度為0.1mg/ml的華蟾素對RCC 786-0作用24h后,可以明顯抑制細(xì)胞侵襲力。QPCR結(jié)果示：RCC 786-0在濃度為0.1mg/ml的華蟾素作用24h后與對照組比,Bax表達(dá)明顯提高,Bcl-2表達(dá)明顯降低,caspase-3表達(dá)無明顯變化。Western blot檢測結(jié)果顯示,RCC 786-0在濃度為0.1mg/ml的華蟾素作用24h后與對照組比,Bax和caspase-3表達(dá)明顯提高,Bcl-2表達(dá)明顯降低。結(jié)論華蟾素可抑制RCC細(xì)胞生長,阻滯細(xì)胞周期于GO/G1期,其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞DNA的復(fù)制有關(guān)。華蟾素能夠抑制RCC細(xì)胞侵襲力,其誘導(dǎo)RCC細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡相關(guān)基因Bax,下調(diào)抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:Objective to study the therapeutic effect of cinobufacin in the treatment of renal cell carcinoma (RCC), to culture human 786-0 RCC cell line (Renal cell carcinoma 786-0, RCC 786-0 in vitro, and to intervene with cinobufacin in this cell line. To study the effects of cinobufacin on the proliferation, apoptosis and invasion of RCC 786-0, and on the apoptosis-related genes in cells. To explore the possibility of cinobufacin in the treatment of RCC and to further study its mechanism of anti-tumor. Methods Human RCC 786-0 was subcultured under suitable conditions. After the cell growth was stable, the cell lines were divided into groups, and some groups were treated with different concentrations of cinobufonin to observe the proliferation of the cells in each group by CCK8 method, and the best inhibitory concentration and time point were selected. According to the results, they were divided into three groups: blank group, optimal inhibitory concentration group and positive control group (5-fluorouracil), respectively. After the best inhibition time, the apoptosis and cell cycle of RCC cells in each group were detected by flow cytometry. The invasiveness of RCC cells in each group was detected by Transwell assay. The expression of apoptosis-related genes (Bax and caspase-3) and anti-apoptosis-related genes (Bcl-2) were detected by QPCR and Western blot at RNA and protein levels, respectively. Results the activity of RCC 786-0 was inhibited by cinobufacin at the dose of 0.1mg/ml for 24 h (p0.01). The percentage of cells in G0/G1 phase in cinobufacin group was higher than that in control group, but there was no significant change in S phase, and the proportion of cells in G 2 / M phase was lower than that in control group. These results suggest that cinobufacin can block RCC cells in GO/G1 phase and inhibit DNA replication. The results of QPCR showed that the expression of RCC 786-0 in RCC 786-0 was significantly higher than that in the control group, and the expression of RCC 786-0 was significantly increased compared with that of the control group after 24 hours of treatment with cinobufacin at the concentration of RCC 786-0.The results of QPCR showed that the expression of RCC 786-0 was significantly higher than that of control group. The expression of Bcl-2 was significantly decreased, but the expression of caspase-3 was not changed. The results of. Western blot detection showed that the expression of Bax and caspase-3 was significantly higher in RCC 786-0 than that in control group after 24 hours of treatment with 0.1mg/ml. The expression of Bcl-2 was significantly decreased. Conclusion cinobufacin can inhibit the growth of RCC cells and block the cell cycle in GO/G1 phase. The mechanism may be related to the inhibition of DNA replication. Cinobufacin can inhibit the invasiveness of RCC cells, and its mechanism of inducing apoptosis in RCC cells may be related to the down-regulation of the expression of anti-apoptosis-related gene Bcl-2 by up-regulating the apoptosis-related gene Bax,.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11

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本文編號：2318833