【摘要】：不孕不育一直是生殖健康領(lǐng)域亟待解決的重大科學(xué)問題。在我國約有10%的育齡夫婦面臨此種困境。由于我國人口基數(shù)大,育齡夫婦數(shù)量尤為可觀,新婚夫婦中不孕不育的患者人數(shù)遠(yuǎn)超過百萬。不孕不育癥的病因很多,其中由男方因素引起的約占50%。研究表明,半個(gè)多世紀(jì)以來,人類精液質(zhì)量顯著下降,精子生成障礙已成為男性不育最常見的病因,也是我國成年男性生殖健康面臨的最主要威脅。 精子生成障礙可能與遺傳因子改變(如單核苷酸多態(tài)性,SNP)、環(huán)境污染物(如環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,EDCs)等密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期通過非梗阻性無精子癥(NOA)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了3個(gè)與NOA顯著關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(1p13.3、1p36.3和12p12.1),但仍無法完全解釋精子生成障礙的病因。由于短時(shí)間內(nèi)遺傳變異造成的影響是有限的,所以精子生成障礙也有可能受到了EDCs的影響。實(shí)驗(yàn)室前期已利用代謝組學(xué)平臺建立了一系列EDCs內(nèi)暴露水平的檢測分析方法。 我們的研究假設(shè)是：1.生精關(guān)鍵基因遺傳變異與精子生成障礙易感性有關(guān)；2.關(guān)鍵基因遺傳變異與環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露之間存在交互作用,進(jìn)而影響精子生成。為驗(yàn)證上述假設(shè)：1.基于前期NOA的GWAS研究數(shù)據(jù),采用大樣本病例-對照研究方法,利用高通量測序、基因芯片等技術(shù),全面篩檢與精子生成障礙相關(guān)的遺傳變異；2.通過檢測代表性EDCs在人群中的內(nèi)暴露水平,整合個(gè)體的遺傳信息,評價(jià)基因-環(huán)境交互作用在精子生成障礙中的作用。 第一部分非梗阻性無精子癥(NOA)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)易感區(qū)域、關(guān)鍵基因遺傳變異與精子生成障礙第一節(jié)NOA全基因組關(guān)聯(lián)研究易感區(qū)域遺傳變異與精子生成障礙 目的 精子生成障礙已成為男性不育最常見的病因,也是我國成年男性生殖健康面臨的最主要威脅。非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia,NOA)是男性不育最嚴(yán)重表現(xiàn)形式,約占男性不育的百分之一。實(shí)驗(yàn)室前期在NOA全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association study,GWAS)中發(fā)現(xiàn)3個(gè)NOA易感區(qū)域(1p13.3、1p36.3和12p12.1).GWAS作為尋找復(fù)雜疾病和性狀遺傳易感變異的有效手段被廣泛用于各項(xiàng)研究,但其結(jié)果并不能完全解釋疾病的遺傳異質(zhì)性。同時(shí),由于基因芯片僅包含已報(bào)道的常見的遺傳變異,造成具有潛在功能的低頻及罕見突變被漏檢。由此,我們推測GWAS發(fā)現(xiàn)的3個(gè)易感區(qū)域存在與精子生成障礙相關(guān)的低頻及罕見遺傳變異。 方法 采用兩階段病例對照研究尋找易感區(qū)域與NOA相關(guān)的低頻及罕見遺傳變異。第一階段采用96對配對的病例對照樣本,通過二代測序技術(shù),對3個(gè)無精子癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)區(qū)域(1p13.3、1p36.3和12p12.1)附近基因(PEX10、PRMT6、 SIRPA、SIRPG和SOX5)潛在功能位置(包括外顯子、啟動子及UTR區(qū))進(jìn)行深度測序,篩選與生精障礙相關(guān)的遺傳變異。第二階段則采用大樣本獨(dú)立人群(522個(gè)病例484個(gè)健康生育對照)驗(yàn)證第一階段篩選的與精子生成障礙相關(guān)的遺傳變異。 結(jié)果 通過深度測序,總計(jì)篩選出六個(gè)與精子生成障礙相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)：SIRPA基因上兩個(gè)新的突變分別位于chr20.1902132和chr20.1902301, SIRPG基因rs1048055和rs2281807, SOX5基因的rs11046992和rs146039840。通過獨(dú)立人群驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)SIRPA chr20.1902301GA的突變會降低精子生成障礙風(fēng)險(xiǎn)性[odds ratios (OR)0.47,95%confidence intervals (CI)0.28-0.80](P=6.00×10-3)。Chr20.1902301GA的突變能引起Val233Ile的氨基酸改變,且GA基因型在病例中的分布(4.23%)明顯低于正常對照組(8.60%)o SIRPG rs1048055多態(tài)能夠增加精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)(OR3.93,95%CI1.59-9.70)(P=3.00×10-3)。 結(jié)論 通過對NOA全基因組關(guān)聯(lián)研究風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域進(jìn)行高通量測序,發(fā)現(xiàn)了新的與生精障礙風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的罕見突變,為精子生成障礙及男性不育的分子診斷和靶向治療提供了理論依據(jù)。 第二節(jié)NOA全基因組關(guān)聯(lián)研究關(guān)鍵通路基因遺傳變異與精子生成障礙 目的 GWAS是研究復(fù)雜疾病遺傳變異的有力手段,近期實(shí)驗(yàn)室前期針對NOA的GWAS研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與生精障礙的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)(1p13.3、1p36.3和12p12.1)。這些變異位點(diǎn)經(jīng)歷嚴(yán)格的多重比較校正,僅能解釋非梗阻性無精子癥很小一部分病因。大部分沒有通過GWAS界值(P10-8)且效應(yīng)“溫和’’的位點(diǎn)在GWAS研究中被忽略。在前期研究的基礎(chǔ)上,我們采用大樣本病例對照研究(1653例生精障礙病例和2329例正常生育對照)方法,尋找未達(dá)到GWAS界值的可能在精子生成過程中發(fā)揮潛在作用的遺傳變異位點(diǎn)。 方法 基于NOA的GWAS數(shù)據(jù)庫,采用歸因(imputation)和通路分析方法(pathway analysis)總共分析了與精子生成相關(guān)的11條通路(凋亡、細(xì)胞周期、MAPK、PI3K-AKT、TGF-β、NF-kB、WNT、核受體及染色質(zhì)重塑等通路)中基因的24238個(gè)SNP位點(diǎn),尋找到40個(gè)在GWAS階段和imputation階段都與無精子癥關(guān)聯(lián)且方向一致的位點(diǎn)。然后在大樣本獨(dú)立人群中,采用Taqman OpenArray方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 通過對GWAS數(shù)據(jù)和我們的兩階段驗(yàn)證數(shù)據(jù)聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)位于染色質(zhì)重塑通路的CHD2基因rs1406714位點(diǎn)能夠降低精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)(odds ratio (OR)=0.78,95%confidence interval (CI)=0.68-0.89, Pmeta=1.7×10-4),而位于核受體通路的GNAO1基因rs2126986和凋亡通路中BCL2基因rs7226979位點(diǎn)則會增加生精障礙的風(fēng)險(xiǎn)(rs2126986:OR=1.28,95%CI=1.15-1.41, Pmeta=2.3×10-6; rs7226979:OR=1.21,95%CI=1.11-1.33, Pmeta=4.5×10-5)。 結(jié)論 通過采用歸因分析及通路分析方法,首次發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的與NOA風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因。我們的研究為尋找精子生成障礙相關(guān)基因提供了新的視野,也能夠?yàn)槿蚪M關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果提供補(bǔ)充,為精子生成障礙和男性不育的病因?qū)W提供理論依據(jù)。 第二部分代表性EDCs暴露、關(guān)鍵基因遺傳變異互作與精子生成障礙第一節(jié)植物雌激素暴露、代謝酶基因遺傳變異互作與精子生成障礙 目的 植物雌激素是一類來源于植物的代表性EDCs,大量存在于豆類植物和含豆粉食物。由于中國的傳統(tǒng)飲食習(xí)慣,人們有大量的機(jī)會暴露于植物雌激素。植物雌激素能夠與雌激素受體結(jié)合,發(fā)揮擬雌激素效應(yīng)影響男性生殖功能。目前中國漢族人群中還未見植物雌激素暴露對男性生殖功能影響的報(bào)道。此外,個(gè)體對植物雌激素的代謝能力是否會改變植物雌激素對生殖功能影響還不清楚。本研究從個(gè)體對植物雌激素的代謝能力出發(fā),研究植物雌激素暴露、個(gè)體易感性與植物雌激素代謝之間是否存在交互作用并影響男性生殖功能。 方法 通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法,分析了1001例(600例不育病例,401例正常生育對照)漢族非職業(yè)男性尿液中兩種植物雌激素原型(開環(huán)異落葉松酚和大豆苷元)及他們的三種代謝產(chǎn)物(腸二醇、腸內(nèi)酯和雌馬酚)的內(nèi)暴露水平,評價(jià)植物雌激素暴露及其代謝對精子生成及男性不育的影響。同時(shí)結(jié)合GWAS研究數(shù)據(jù),采用Taqman方法同時(shí)對這部分人群的代謝酶多態(tài)進(jìn)行了研究。通過似然比檢驗(yàn)和逐步回歸法,探討了植物雌激素暴露、代謝酶基因遺傳變異互作對男性不育的影響。 結(jié)果 高暴露于開環(huán)異落葉松酚(SEC)會增加精液參數(shù)異常及男性不育的風(fēng)險(xiǎn)(odds ratio (OR)=1.78,95%confidence intervals (CI)=1.28-2.49,Ptrend=8.00×10-8),但是其代謝產(chǎn)物(腸二醇和腸內(nèi)酯)則會降低男性不育的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.53,95%CI=0.38-0.73, Ptrend=4.00×10-8)。由于單獨(dú)考慮原型或代謝物的暴露存在偏移,我們采用代謝率全面評價(jià)植物雌激素暴露對男性生殖功能的影響。發(fā)現(xiàn)SEC較低的代謝率能夠增加男性不育的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.49,95%CI=1.78-3.48, Ptrend=8.00×10-8)。且SEC的代謝率與CYP2B6rs1042389、CYP1A1rs1048943和NAT2rs1799931之間存在交互作用,會增加精液質(zhì)量異常及男性不育的風(fēng)險(xiǎn)(Pinter=1.06×10-4,1.14×10-3,3.55×10-3)。 結(jié)論 通過檢測人群尿液中植物雌激素原型及其代謝物的內(nèi)暴露水平,分析個(gè)體代謝能力的差異及其遺傳背景,發(fā)現(xiàn)個(gè)體對于植物雌激素的代謝能力與遺傳背景存在著密切關(guān)聯(lián),并且存在交互作用影響男性生殖功能。我們的研究為建立中國人群的植物雌激素暴露數(shù)據(jù)庫提供了基礎(chǔ)資料。 第二節(jié)環(huán)境酚類暴露、關(guān)鍵基因遺傳變異互作與精子生成障礙 目的 辛基酚和氯酚均屬于EDCs中的代表性酚類物質(zhì),用于有機(jī)合成、醫(yī)藥、農(nóng)藥、油漆等各個(gè)行業(yè),能夠干擾體內(nèi)雌激素和雄激素的平衡而影響男性生殖功能。目前有關(guān)漢族人群中辛基酚和氯酚類暴露與男性不育的研究幾乎是空白,缺乏流行病學(xué)資料。我們通過代謝組學(xué)平臺研究了辛基酚和氯酚暴露是否與精液質(zhì)量及男性不育相關(guān),其中關(guān)鍵基因遺傳變異是否也發(fā)揮潛在作用。 方法 采用UPLC-MS/MS檢測漢族非職業(yè)人群(589例男性不育病例和396例正常生育男性)尿液中辛基酚(4-t-辛基酚和4-n-辛基酚)和氯酚(2,3,4-三氯酚和2,4,5-三氯酚)的內(nèi)暴露水平,采用Taqman方法檢測這些個(gè)體的代謝酶多態(tài)。通過logistic多因素回歸及似然比檢驗(yàn),分析酚類物質(zhì)暴露與個(gè)體遺傳背景是否存在交互作用及其對精子生成的影響。 結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn),高暴露于4-t-辛基酚能夠顯著增加男性不育的風(fēng)險(xiǎn)(Ptrend=1.70×10-7),且高暴露于4-t-辛基酚與CYP2C9rs4918758. CYP2C19rs4986894和CYPlAl rs1048943存在交互作用,增加男性不育的風(fēng)險(xiǎn)(Pinter=6.05×10-7,8.09×10-7,3.73×10-4)。其中,4-t-辛基酚暴露與CYP2C9rs4918758之間的交互作用最顯著,隨著暴露水平的增加,男性不育的風(fēng)險(xiǎn)呈單調(diào)遞增趨勢。在包含rs4918758突變型的TC/CC組,低暴露組相對于無暴露組,odds ratio (OR)=2.26,95%confidence intervals (CI)=1.06-4.83,而高暴露組相對于無暴露組則OR=9.22,95%CI=2.78-30.59。 結(jié)論 通過大樣本人群研究,發(fā)現(xiàn)4-t-辛基酚暴露與個(gè)體代謝酶多態(tài)之間存在交互作用,本研究為4-t-辛基酚暴露的高危人群篩選和危險(xiǎn)度評估提供了科學(xué)依據(jù),有助于闡明引起精子生成障礙和男性不育的環(huán)境危險(xiǎn)因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R698.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2312825