【摘要】：目的:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是一種糖尿病(Diabetes mellitus,DM)主要而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,其發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜,其發(fā)生發(fā)展涉及多個因素參與,近年來不少研究表明,氧化應(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng)可能參與糖尿病腎損害的不同病理過程并發(fā)揮核心作用。我們的前期研究表明,高糖可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,激活活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide binding and oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎癥小體信號通路,誘導(dǎo)活半胱氨酸蛋白酶1(Cysteine-aspartic acid protease1,Caspase1)及促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1-β(Interleukine-1 beta,IL-1β)的成熟與分泌。自噬(Autophagy)是一種清除損傷蛋白質(zhì)或細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的降解過程,通過清除損傷線粒體減少ROS產(chǎn)生而實現(xiàn)能量回收,可能參與調(diào)節(jié)ROS及下游的NLRP3炎癥小體信號通路,避免過度的免疫炎癥反應(yīng)。然而到目前為止,高糖刺激下腎系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cell,GMC)的自噬水平及調(diào)節(jié)機(jī)制研究尚少,且研究結(jié)果存在爭議,既往研究表明,適當(dāng)增強(qiáng)自噬可能減少氧化應(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng),但過度自噬可能引起自噬性細(xì)胞損傷,加重細(xì)胞凋亡。在有限的自噬調(diào)節(jié)機(jī)制研究中,受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸激酶2(Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2,RIPK2),一種Nod樣受體(Nod-like receptor,NLR)家族中Nod1/Nod2的重要連接蛋白,被證明既可激活核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)及絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),還參與Nod1/Nod2介導(dǎo)的自噬反應(yīng),提示RIPK2可能參與調(diào)節(jié)自噬及ROS-NLRP3炎癥小體信號通路,但目前尚缺乏研究探討高糖刺激腎系膜細(xì)胞對RIPK2以及RIPK2與自噬、ROS-NLRP3炎癥小體信號通路的影響,因此本研究通過觀察小鼠腎系膜細(xì)胞中RIPK2、LC3II/I、ROS、Caspase1、IL-1β在不同時間及不同濃度高糖干預(yù)下的表達(dá)變化,同時檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β表達(dá),再通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2-siRNA干擾RIPK2后再次觀察自噬水平及ROS-NLRP3炎癥小體關(guān)鍵因子的改變,旨在探討高糖對腎系膜細(xì)胞RIPK2、自噬的影響以及自噬對ROS-NLRP3炎癥小體信號通路的調(diào)控作用,為DN的防治提供新的思路。方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)及分組:體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40),以高糖作為刺激因素,分為以下三組:(1)正常對照組(Normal control group,NC組):培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖;(2)滲透壓對照組(Osmotic pressure group,OP組):培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇。(3)不同高糖濃度干預(yù)組(High glucose group,HG組):培養(yǎng)基分別含10 mmol/L葡萄糖(HG1組)、20 mmol/L葡萄糖(HG2組)、30 mmol/L葡萄糖(HG3組);(2)各組細(xì)胞培養(yǎng)0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后,用Western-blot檢測RIPK2、LC3II/I、Caspase1、IL-1β的蛋白表達(dá);RT-PCR檢測RIPK2、Caspase1、IL-1βmRNA表達(dá);mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒標(biāo)記LC3以觀察自噬流;各組細(xì)胞適時隨機(jī)加入處理因素后裝載2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(2’,7’-Dichlorofluorescin Diacetate,DCFH—DA),并用分光光度計檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化;ELISA檢測培養(yǎng)上清液IL-1β濃度。(3)RIPK2的siRNA干擾研究:篩選出最佳高糖作用濃度(30mmol/L)和時間(12h)后,細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA,再次進(jìn)行分組:(1)siNC組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA加入含5.6 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h;(2)si RIPK2組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2siRNA加入含5.6 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h;(3)HG+siNC組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA加入含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h;(4)HG+siRIPK2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 si RNA加入含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h;再次采用Western-blot、RT-PCR、mRFP-GFP-LC3標(biāo)記+共聚焦顯微鏡、DCFH—DA標(biāo)記+分光光度計及ELISA等方法檢測上述指標(biāo)。(4)統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?)表示,采用單因素方差分析對多組間均數(shù)進(jìn)行比較,組間多重比較用LSD—t法。我們定義P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:(1)與NC組相比,高糖刺激可增加細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、Caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表達(dá),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.05),且具有時間及濃度依賴性。(2)與NC組相比,高糖在短期作用時間內(nèi)(0-12h)可誘導(dǎo)RIPK2、LC3II/I蛋白及RIPK2mRNA表達(dá)(P0.05),且在30 mmol/L高糖作用12h條件下表達(dá)顯著增強(qiáng),超過12h作用時間后RIPK2及LC3II/I表達(dá)下調(diào)(P0.05)。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA后成功抑制RIPK2表達(dá)。與siNC組相比,siRIPK2組LC3II/I表達(dá)顯著下調(diào),而細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、Caspase1及IL-1β蛋白表達(dá)則顯著增加(P0.05)。結(jié)論:(1)高糖可激活小鼠腎系膜細(xì)胞ROS-NLRP3炎癥小體信號通路。(2)高糖對腎小球系膜細(xì)胞自噬具有雙重調(diào)控作用,即高糖刺激可在短期內(nèi)誘導(dǎo)自噬激活而在長期作用時間下內(nèi)起抑制效應(yīng)。(3)RIPK2通過自噬負(fù)性調(diào)節(jié)ROS-NLRP3炎癥小體信號通路,可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
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【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 李錦;白雪源;崔少遠(yuǎn);傅博;陳香美;;雷帕霉素對高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞自噬抑制、氧化損傷和衰老的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年04期

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本文編號：2287994