【摘要】：研究背景 糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者病程進(jìn)展中最常見的并發(fā)癥,其主要病理改變是腎小球微血管發(fā)生病變,是糖尿病的微血管并發(fā)癥,糖尿病腎病的總體療效和遠(yuǎn)期預(yù)后較差,是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因,糖尿病一旦發(fā)展到并發(fā)腎臟損害,多數(shù)患者就會很快進(jìn)展到終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)。一旦發(fā)展到ESRD,往往比其它腎臟疾病治療更加棘手,另外終末期腎臟病醫(yī)療費用較高,不但給患者家庭帶來沉重經(jīng)濟負(fù)擔(dān),也給國家?guī)沓林氐纳鐣?fù)擔(dān),因此積極闡明其致病機制,尋找新的治療靶點,開發(fā)新的藥物,制定療效更佳的防治措施顯得尤為重要和迫切。 目前糖尿病腎病發(fā)病機制仍不能明確,其發(fā)病機制復(fù)雜,近年來國內(nèi)外研究認(rèn)為體內(nèi)長期持續(xù)高糖環(huán)境下形成的大量晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products AGEs)在其整個病程進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。糖尿病腎病發(fā)生的一個標(biāo)志性事件就是腎小球微血管通透性增高形成微量蛋白尿。研究認(rèn)為腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cells, GECs)通透性的增加在蛋白尿的產(chǎn)生過程中起到關(guān)鍵性的作用,而血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高主要通過跨細(xì)胞途徑來實現(xiàn),即內(nèi)皮細(xì)胞間連接破壞,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增高使液體和大分子物質(zhì)流出。而細(xì)胞間鏈接破壞主要是通過內(nèi)皮細(xì)胞收縮,細(xì)胞形態(tài)變圓,細(xì)胞間隙增大,形成細(xì)胞旁通路等一系列細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能變化來實現(xiàn)的。深入研究發(fā)現(xiàn)血管通透性增高關(guān)鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞間連接的破壞和由此導(dǎo)致的細(xì)胞間裂隙形成,而細(xì)胞間裂隙形成是血液中大分子物質(zhì)如白蛋白漏出血管壁的重要途徑。血管內(nèi)皮細(xì)胞的骨架蛋白和連接蛋白是構(gòu)成血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞骨架特別是肌動蛋白在各種致病因素刺激下的重構(gòu)和再分布是引起內(nèi)皮細(xì)胞回縮、細(xì)胞形態(tài)及功能改變、細(xì)胞間裂隙的形成、通透性增高等一系列結(jié)構(gòu)和功能改變的病理基礎(chǔ)。肌動蛋白細(xì)胞骨架的裝配和重構(gòu)受到多個因素調(diào)控,其中Rac1信號是最關(guān)鍵的調(diào)控環(huán)節(jié),而Rac1參與調(diào)控的具體機制目前仍不清楚,因此非常值得研究。 研究表明AGEs可以引起皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加,并且AGEs以劑量和時問依賴的方式引起皮肽微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,因此,我們推測AGEs應(yīng)該也能引起腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增高,從而進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生,但國內(nèi)這方面研究較少,因此非常值得研究。另外更重要的是開展此項研究對于闡明AGEs在糖尿病腎病發(fā)病和進(jìn)展中起到怎樣的作用及具體作用機制如何具有重要意義,有利于尋找新的更為有效的防治措施來防治糖尿病腎病這一臨床難題。綜合上述本研究進(jìn)行如下設(shè)想來闡明(1) AGEs是否能夠引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增高?(2) AGEs是否通過調(diào)節(jié)改變腎小球內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin及肌動蛋白結(jié)合蛋白cortactin的變化而調(diào)節(jié)其通透性?(3) AGEs是否通過Rac1信號通路調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性?為闡述上述問題本研究擬進(jìn)行以下幾個方面的工作。 1.建立分離和培養(yǎng)原代大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的方法。 2.觀察AGEs刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞后其細(xì)胞通透性的改變情況及細(xì)胞骨架蛋白F-actin及cortactin形態(tài)學(xué)改變情況。 3.觀察AGEs刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞后其Rac1活性改變,探討AGEs誘發(fā)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加是否與Rac1信號通路有關(guān)。 目的 本研究的目的是想利用體外培養(yǎng)細(xì)胞實驗來闡明：AGEs對體外培養(yǎng)大鼠GECs通透性的影響；AGEs對大鼠GECs骨架蛋白的結(jié)構(gòu)和分布的影響及細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能的變化特征；AGEs介導(dǎo)大鼠GECs通透性變化的作用機制是否與Rac1信號通路有關(guān)?進(jìn)一步為臨床防治DN提供新的靶點和思路。 方法 體外培養(yǎng)大鼠原代GECs細(xì)胞,分別以不同濃度的AGEs修飾的人血清白蛋白(HSA)處理不同時間,并設(shè)立對照組進(jìn)行比較。用免疫熒光染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架肌動蛋白F-actin,皮層肌動蛋白結(jié)合蛋白Cortactin的形態(tài)及分布；用Rac1激動劑O-Me-cAMP預(yù)處理細(xì)胞1h后,與前者進(jìn)行對比,同時用pull-down assay法檢測Rac1活性的變化；跨細(xì)胞電阻TER和FITC熒光標(biāo)記白蛋白平均通透系數(shù)來檢測單層GECs細(xì)胞通透性改變。 結(jié)果 1.腎組織塊法行原代腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察,腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,并采用植物凝集素結(jié)合試驗進(jìn)行鑒定。 2.用不同濃度劑量的AGEs刺激孵育8小時后,隨著AGEs濃度的增加其單層GECs的TER平均值逐漸降低,FITC-BSA的平均通透系數(shù)逐漸增加。結(jié)果提示單層GECs通透性隨AGEs濃度的增加而逐漸增高,表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。相同濃度的AGEs (100μg/ml)刺激孵育單層GECs不同時間后,隨著AGEs刺激時間延長,單層GECs的TER平均值逐漸降低,FITC-BSA的平均通透系數(shù)逐漸增加,提示單層GECs通透性隨AGEs作用時間增加而逐漸增高,表現(xiàn)為時間依賴關(guān)系。 3.正常情況下,未受AGEs刺激的GECs形態(tài)光滑完整,F-actin主要沿著細(xì)胞膜的周邊、靠近細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)分布,表現(xiàn)圍繞細(xì)胞膜周圍分布狀態(tài),均勻分布,排列整齊,并呈網(wǎng)狀分布排列,而細(xì)胞漿中分布較少,在細(xì)胞長軸方向、靠近細(xì)胞連接處呈細(xì)絲狀排列,線條連續(xù)整齊。有很少量F-actin分布在細(xì)胞核的周圍,形成核周骨架,細(xì)胞中央應(yīng)力纖維不明顯。而cortactin主要分布在皮質(zhì)區(qū)和細(xì)胞膜上,形狀較為規(guī)則,胞漿部位也有少量分布。隨著AGEs-HSA濃度的增加或作用時間的增加,F-actin外周致密帶邊緣逐漸變得毛糙紊亂,排列不規(guī)整,逐漸出現(xiàn)典型的鋸齒樣結(jié)構(gòu)。F-actin呈彌散分布在細(xì)胞內(nèi),F-actin重組和再分布,從細(xì)胞周邊向細(xì)胞中心轉(zhuǎn)移,并成平行束狀堆積、增厚,細(xì)胞應(yīng)力纖維逐漸增多,而胞漿中分布的cortactin逐漸變得明顯增多且較紊亂,皮質(zhì)區(qū)和細(xì)胞膜上的分布逐漸減少和不明顯,出現(xiàn)移位分布,AGEs-HSA濃度達(dá)至100μg/mL時或作用時間達(dá)至8小時后,細(xì)胞邊界模糊、有明顯回縮趨勢,這一作用具有明顯的劑量依賴關(guān)系。而空白對照組和HSA蛋白對照組F-actin和cortactin形態(tài)及分布無明顯影響。對細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變。 4.用特異性激活劑O-Me-cAMP(2umol/ml)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞后,AGEs-HSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞F-actin結(jié)構(gòu)重構(gòu)、cortactin分布紊亂、中央應(yīng)力纖維的形成及細(xì)胞形態(tài)的回縮的現(xiàn)象明顯被抑制,HSA對細(xì)胞沒有明顯的作用。該結(jié)果提示Rac1信號通路參與了AGEs介導(dǎo)的GECs形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變。 5.與空白對照組相比,GECs經(jīng)過AGEs-HA(100μg/ml)刺激培養(yǎng)8小時后其細(xì)胞內(nèi)Rac1活性水平明顯降低(P0.01),但對Rac1總蛋白沒有明顯的影響,單獨HSA沒有這樣的作用,該結(jié)果進(jìn)一步提示Rac1在AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能改變中具有重要作用。 6.Rac1激動劑O-Me-cAMP可有效抑制AGEs降低單層GECs的平均TER和有效抑制AGEs增加單層GECs的FITC-BSA通透系數(shù)的改變。提示Rac1激動劑O-Me-cAMP可以抑制由AGEs誘導(dǎo)的單層GECs通透性增加效應(yīng)。 結(jié)論 1.AGEs能夠增加大鼠GECs的通透性,且表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系和時間依賴關(guān)系。 2. AGEs能夠通過改變細(xì)胞骨架蛋白F-actin和皮質(zhì)區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白cortactin結(jié)構(gòu)和分布影響大鼠GECs的形態(tài)和功能改變從而影響其通透性改變。 3.Rac1信號通路在AGEs介導(dǎo)的大鼠GECs形態(tài)和功能改變中發(fā)揮了重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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3 王吉萍;郭曉華;王陵軍;李強;陳波;吳煒;黃緒亮;黃巧冰;;Rho/ROCK信號通路參與晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變[J];生理學(xué)報;2009年02期

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本文編號：2284698