【摘要】：背景：膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中的常見腫瘤,其中90%的組織學(xué)類型為膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)。盡管經(jīng)過了多年的深入研究和探索,但BUC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制仍不十分明朗。目前針對(duì)BUC的各種治療手段仍不能讓人完全滿意,BUC患者的總體預(yù)后仍不容樂觀。因此,深入研究探索BUC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于提高BUC的診療水平和改善BUC患者的預(yù)后具有十分重大的價(jià)值。 高遷移率族蛋白1(high-mobility group box1, HMGB1)是一種在真核生物的細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的非組蛋白核蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn),HMGB1與腫瘤的無限增殖,抵抗凋亡,新生血管生成,浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。但目前國內(nèi)外對(duì)于HMGB1在BUC中的表達(dá)研究較少,其對(duì)BUC生物學(xué)行為的影響及其在BUC發(fā)生發(fā)展中所起的作用還不清楚。 目的：(1)研究HMGB1在BUC組織及細(xì)胞株中的表達(dá)情況,分析HMGB1的表達(dá)和BUC臨床病理因素之間的關(guān)系。(2)探索構(gòu)建靶向HMGB1的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人BUC細(xì)胞株T24來特異性的沉默HMGB1基因的表達(dá)。(3)研究shRNA介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)T24細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響及T24細(xì)胞生物學(xué)活性的變化。(4)初步研究HMGB1影響人BUC細(xì)胞生物學(xué)行為可能的下游作用機(jī)制。 方法：(1)收集30例BUC組織及其配對(duì)的癌旁組織,采用Western-blot和實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)分析BUC組織和細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平,同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測HMGB1蛋白的表達(dá)程度和定位,分析其表達(dá)水平和BUC臨床病理因素之間的關(guān)系。(2)探索構(gòu)建靶向HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體并采用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞來特異性的沉默HMGB1的表達(dá),采用Western-blot和Real-time PCR檢測shRNA干擾序列對(duì)HMGB1表達(dá)的影響。(3)采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)研究pGPU6/GFP/Neo-HMGB1shRNA-539表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和細(xì)胞周期的變化。(4)采用Western-blot和Real-time PCR檢測HMGB1干擾序列轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor kappa B/p65, NF-κB/p65)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-C (vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表達(dá)水平,同時(shí)采用間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)來分別檢測NF-κB/p65在細(xì)胞內(nèi)的定位情況和活性變化。 結(jié)果：(1) HMGB1在BUC組織中高表達(dá),其表達(dá)水平顯著高于配對(duì)的癌旁組織；IHC結(jié)果顯示HMGB1的陽性染色顆粒絕大部分位于細(xì)胞核,少部分位于細(xì)胞漿；結(jié)合患者的臨床病理資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)HMGB1的表達(dá)水平與患者的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期呈正相關(guān)；同時(shí),HMGB1在5637、BIU-87和T24細(xì)胞中的表達(dá)水平逐次升高,與BUC細(xì)胞的惡性程度相關(guān)。(2)實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了特異性干擾HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞；經(jīng)檢測3條shRNA均可以特異性的抑制HMGB1的表達(dá),其中以HMGB1shRNA-539抑制效率最高。(3)特異性的干擾HMGB1基因的表達(dá)能在體外抑制T24細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期遲滯和細(xì)胞凋亡。(4) HMGB1干擾序列轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后NF-κB/p65和VEGF-C的表達(dá)水平下調(diào)；同時(shí)NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位減少活性降低。 結(jié)論：(1) HMGB1的表達(dá)水平在BUC組織和細(xì)胞中明顯增高,且與BUC的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期正相關(guān),HMGB1可能與BUC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。(2)特異性的下調(diào)T24細(xì)胞HMGB1的表達(dá)可以顯著抑制其增殖、遷移、侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期遲滯和細(xì)胞凋亡,HMGB1可以作為BUC基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。(3)特異性的下調(diào)T24細(xì)胞HMGB1基因的表達(dá)可以引起細(xì)胞中NF-κB/p65和VEGF-C的表達(dá)下調(diào),進(jìn)而抑制NF-κB/p65的活性和核轉(zhuǎn)位,提示HMGB1對(duì)VEGF-C的調(diào)節(jié)可能是由NF-κB通路來實(shí)現(xiàn)的。圖25幅,表35個(gè),參考文獻(xiàn)135篇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 黃慶先,王國斌,孫念峰,王春友;高遷移率族蛋白框1反義核酸抑制人胰腺癌細(xì)胞系PCNA-1侵襲的研究[J];癌癥;2004年09期

2 劉懿;張鵬;吳志浩;陳軍;周清華;;高表達(dá)HMGB1肺癌細(xì)胞系的篩選及意義[J];中國肺癌雜志;2009年09期

3 宋舟;劉屹;包國強(qiáng);何顯力;馬慶久;;HMGB1在大腸癌組織中的表達(dá)及其意義[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2008年07期

4 張明星;尹麗霞;竇中嶺;史海軍;王曉彬;劉輝;;HMGB1和MMP2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2012年04期

5 ;VEGF、VEGF-C和VEGFR-3蛋白表達(dá)增加與前列腺癌進(jìn)展期的相關(guān)性研究(英文)[J];Asian Journal of Andrology;2006年02期

6 ;Growth suppression and radiosensitivity increase by HMGB1 in breast cancer[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年12期

7 康睿;唐道林;曹勵(lì)之;俞燕;張國元;肖獻(xiàn)忠;;急性淋巴細(xì)胞性白血病患兒血清高遷移率族蛋白1檢測及其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華兒科雜志;2007年05期

8 V銉lp K.;Brezniceanu M.-L.;B銉sser S.;M. Z銉r(jià)nig;劉麗娜;;人結(jié)腸癌HMGB1基因表達(dá)增加與抗凋亡蛋白c-IAP2水平增高的相關(guān)性[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(胃腸病學(xué)分冊(cè));2006年Z1期

9 來雷;楊林軍;翟昌林;;RNAi干擾HMGB1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖的影響[J];中國現(xiàn)代醫(yī)生;2012年24期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳若蟬;HMGB1在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及潛在作用[D];中南大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：2278173