發(fā)布時(shí)間：2018-10-11 06:56

【摘要】：研究背景及目的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是臨床上常見的危重疾病。AKI的發(fā)生率、病死率逐年升高,在普通人群中的發(fā)生率約為0.25%,住院患者中可達(dá)18%,在重癥監(jiān)護(hù)病房則高達(dá)30%-60%。AKI普通人群中的死亡率約為8.8%,在危重癥患者中死亡率可高達(dá)50-80%。然而,有隨訪研究表明,約33.6%的重度患者在出院14個(gè)月后會(huì)進(jìn)展為CKD甚至是ESRD。然而,AKI進(jìn)展為CKD的機(jī)制目前仍未探明。腎小管上皮細(xì)胞中線粒體數(shù)量多,代謝旺盛,對(duì)缺血、缺氧等刺激十分敏感。研究發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞在發(fā)生缺血再灌注的數(shù)小時(shí)內(nèi)即可觀察到應(yīng)激性衰老的發(fā)生。因此,衰老作為缺血再灌注后細(xì)胞重要的生物學(xué)事件之一,在AKI-CKD進(jìn)展中的作用受到了廣泛的關(guān)注。由于衰老細(xì)胞可以分泌大量促纖維化因子、促炎因子、趨化因子、生長因子、基質(zhì)和蛋白酶等衰老相關(guān)分泌表型(senescence associated secretory phenotype,SASP),加重腎組織的局部炎癥反應(yīng),促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。同時(shí),衰老細(xì)胞還通過發(fā)揮凋亡抵抗作用使其不易被巨噬細(xì)胞清除而滯留于損傷部位,以致?lián)p害效應(yīng)不斷加重。綜上所述,缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激性衰老,影響了腎組織的修復(fù)并通過釋放SASP進(jìn)一步加重腎組織的損傷,因而導(dǎo)致腎功能不斷惡化,逐步進(jìn)展為慢性腎臟病甚至是終末期腎臟疾病。DcR2作為腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的受體之一,具有凋亡抵抗作用。同時(shí),DcR2也可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志,在腫瘤細(xì)胞和衰老的成纖維細(xì)胞以及體外高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),通過干預(yù)DcR2表達(dá),肝臟纖維化程度減輕,提示DcR2可能在纖維化進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。另外,DcR2作為跨膜受體,其胞外段可被蛋白酶剪切形成具有生物功能活性的可溶性分子,因此DcR2可在血清中檢測(cè)到。然而,截至目前DcR2在缺血再灌注大鼠腎組織和尿液中的表達(dá)水平以及與腎組織慢性化之間的關(guān)系尚無研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要包括以下三方面,首先為缺血再灌注大鼠腎組織DcR2表達(dá)及uDcR2/Cr水平與腎功能及腎組織慢性評(píng)分的相關(guān)性分析;其次,缺血再灌注大鼠腎組織中DcR2與腎間質(zhì)纖維化標(biāo)志物α-SMA、Collagen IV的關(guān)系;最后,缺血再灌注大鼠腎組織中DcR2與衰老標(biāo)志物SA-β-gal、P16Ink4a的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法:1.構(gòu)建輕、重度I/R大鼠腎損傷模型隨機(jī)選取健康雄性SD大鼠,用無損動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂制備大鼠缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷模型。輕度損傷(I/R45min)和重度損傷(I/R60min)模型分別夾閉45min、60min后放開雙側(cè)動(dòng)脈夾給予腎臟再灌注。假手術(shù)(sham)模型,僅分離雙側(cè)腎蒂但不用動(dòng)脈夾夾閉,其它操作步驟與I/R組相同。2.檢測(cè)兩組I/R大鼠腎功能制備I/R大鼠腎損傷模型后,分別于術(shù)后1、3、7、21、35天收集雙側(cè)腎組織,腹主動(dòng)脈穿刺采集血液2ml,代謝籠收集24小時(shí)尿液。檢測(cè)各組血肌酐(Serum creatinine,Scr)、尿NAG酶水平。3.兩組I/R大鼠腎組織慢性化評(píng)分制備I/R大鼠腎損傷模型后,分別于術(shù)后1、3、7、21、35天收集雙側(cè)腎組織,10%福爾馬林多聚甲醛室溫固定,24小時(shí)后進(jìn)行石蠟包埋制備蠟塊。石蠟切片(厚度2μm),常規(guī)脫蠟、水化后進(jìn)行PAS染色和Masson染色。使用高倍顯微鏡,在200倍視野下,采用雙盲法,由兩名醫(yī)師共同觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化并按照下述方法進(jìn)行腎組織慢性化評(píng)分[8,9]。隨機(jī)選取腎組織皮髓交界區(qū)域10個(gè)不連續(xù)的視野,計(jì)算炎細(xì)胞浸潤、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化面積的比例:0分,無損傷;1分,25%;2分,25%~50%;3分,51%~75%;4分75。4.免疫組化檢測(cè)兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)選取待檢測(cè)的大鼠腎組織蠟塊,石蠟切片(厚度2μm),常規(guī)脫蠟、水化后行免疫組化檢測(cè)腎組織DcR2表達(dá)。在高倍顯微鏡,200倍視野下計(jì)數(shù),每個(gè)腎組織隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)的視野。鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)被染成棕色即為DcR2陽性。計(jì)算DcR2陽性區(qū)域面積占總面積的比例,0分:0%~5%;1分:6%~25%;2分:26%~50%;3分:51%~75%;4分:≥76%[10]。5.ELISA檢測(cè)兩組I/R大鼠uDcR2/Cr水平制備I/R大鼠腎損傷模型,分別于術(shù)后1、3、7、21、35天使用代謝籠收集24小時(shí)尿液,3000 rpm/分鐘離心20-30分鐘,吸取上層血清。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)尿DcR2(uDcR2)水平并使用尿肌酐校正,結(jié)果以u(píng)DcR2/Cr表示。6.兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)量及uDcR2/Cr水平與腎功能及腎組織慢性化評(píng)分的相關(guān)性分析腎組織DcR2的表達(dá)及uDcR2水平與腎功能及腎組織慢性化評(píng)分的相關(guān)性使用spearman統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法。7.免疫熒光共染檢測(cè)I/R60min大鼠腎組織DcR2與纖維化標(biāo)志的表達(dá)關(guān)系(1)免疫熒光共染檢測(cè)缺血再灌注7天后兩組I/R大鼠模型腎組織DcR2與纖維化指標(biāo)α-SMA和Collagen IV的共表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分。使用高倍顯微鏡,在200倍視野下,隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù),采用雙盲法,由兩名醫(yī)師共同實(shí)施。計(jì)算α-SMA和Collagen IV陽性區(qū)域面積:0分,無;1分,25%;2分,25%~50%;3分,51%~75%;4分,75%[10]。(2)使用spearman分析I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)量與腎間質(zhì)纖維化程度的關(guān)系。8.免疫化學(xué)染色檢測(cè)I/R60min大鼠腎組織DcR2與衰老標(biāo)志的表達(dá)關(guān)系(1)免疫組化和SA-β-Gal染色檢測(cè)腎組織DcR2與SA-β-Gal的共表達(dá)情況。高倍顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)呈DcR2和SA-β-Gal雙陽性表達(dá)的腎小管的比例。(2)免疫熒光共染檢測(cè)腎組織DcR2和P16Ink4a共表達(dá)情況。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)呈DcR2和P16Ink4a雙陽性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.兩組I/R大鼠腎功能變化I/R45min及I/R60min大鼠Scr、u NAG/Cr水平顯著高于Sham組。I/R45min大鼠再灌注1天后Scr水平到達(dá)峰值后逐漸下降,35天時(shí)Scr水平已降至正常(P0.05)。I/R60min大鼠各時(shí)間點(diǎn)Scr水平均顯著高于I/R45min,再灌注3天Scr水平到達(dá)峰值后逐漸下降,但35天時(shí)仍有80%的大鼠Scr未恢復(fù)正常。uNAG/Cr變化與Scr基本相同,I/R45min大鼠uNAG/Cr再灌注1天后逐漸恢復(fù)正常,而I/R60min大鼠再灌注35天u NAG/Cr仍高于正常水平(P0.05)。2.兩組I/R大鼠腎組織慢性化評(píng)分缺血再灌注后皮髓交界區(qū)域出現(xiàn)廣泛的腎小管壞死、脫落等急性病理損傷表現(xiàn)。與Sham組(0分)相比,再灌注35天I/R45min大鼠腎組織基本恢復(fù)正常,腎組織慢性化評(píng)分為(3.67±0.58)分。I/R60min與I/R45min相比,病理損傷程度明顯加重,并在35天可觀察到30%以上區(qū)域出現(xiàn)腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化等慢性化表現(xiàn),腎組織慢性化評(píng)分為(8.33±1.29)分。3.兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)與分布DcR2僅在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá),正常腎組織DcR2低表達(dá)。I/R45min大鼠再灌注1天腎組織DcR2表達(dá)量到達(dá)峰值,隨后逐漸下降,再灌注35天DcR2表達(dá)量與Sham組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。I/R60min大鼠DcR2表達(dá)量明顯高于I/R45min,再灌注3天到達(dá)峰值后逐漸下降,但35天時(shí)仍有大量DcR2表達(dá),與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。DcR2高表達(dá)主要見于修復(fù)不良的區(qū)域,而DcR2低表達(dá)部位腎組織修復(fù)良好。4.兩組I/R大鼠uDcR2/Cr水平Sham組uDcR2水平低下,缺血再灌注后uDcR2水平顯著升高。I/R45min組大鼠再灌注后第1天uDcR2水平明顯升高并到達(dá)峰值,后隨再灌注時(shí)間延長uDcR2/Cr水平逐漸降低,再灌注第35天時(shí)uDcR2/Cr水平降至正常(P0.05)。I/R60min大鼠再灌注第3天uDcR2水平到達(dá)峰值,隨著再灌注時(shí)間延長uDcR2水平逐漸降低但仍明顯高于Sham組(P0.05)。5.兩組I/R大鼠腎組織及尿液DcR2變化與腎功能及組織慢性化評(píng)分的相關(guān)性分析I/R45min、I/R60min大鼠腎組織DcR2表達(dá)量與Scr、uNAG/Cr及腎組織慢性化評(píng)分呈正相關(guān),I/R45min相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.913、0.829(P0.05);I/R60min相關(guān)系數(shù)分別為0.857、0.909、0.851(P0.05)。I/R45min、I/R60min大鼠uDcR2/Cr水平與Scr、uNAG/Cr及腎組織慢性化評(píng)分呈正相關(guān),I/R45min相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.943、0.886(P0.05);I/R60min相關(guān)系數(shù)分別為0.920、0.847、0.827(P0.05)。6.I/R60min大鼠腎組織DcR2與腎小管間質(zhì)纖維化標(biāo)志的關(guān)系免疫熒光共染結(jié)果示,I/R60min大鼠再灌注21、35天可見DcR2陽性腎小管及陽性區(qū)域高表達(dá)α-SMA和Collagen IV,DcR2與腎小管間質(zhì)纖維化標(biāo)志α-SMA和Collagen IV的表達(dá)成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.885、0.806(P0.05)。提示DcR2與缺血再灌注后腎組織慢性化有關(guān)。7.I/R60min大鼠腎組織DcR2與衰老標(biāo)志的關(guān)系免疫化學(xué)染色結(jié)果示,I/R60min組大鼠腎組織SA-β-gal、P16Ink4a隨著再灌注時(shí)間延長表達(dá)增加,并且85%以上的DcR2陽性腎小管高表達(dá)SA-β-gal、P16Ink4a。提示DcR2陽性的腎小管上皮細(xì)胞具有衰老表型。結(jié)論本研究證實(shí)了輕、重度缺血在灌注損傷模型中腎組織DcR2的表達(dá)與腎組織慢性化以及與腎小管細(xì)胞衰老密切相關(guān),表明了DcR2可能在腎組織修復(fù)不良中發(fā)揮重要作用。同時(shí),uDcR2/Cr水平在腎組織修復(fù)期明顯增高,因此,uDcR2/Cr可能是評(píng)估缺血再灌注腎損傷的潛在預(yù)后因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 霍本剛;戴歡子;張建國;楊聚榮;李開龍;林利容;陳佳;張湖海;何婭妮;;IgA腎病腎組織誘騙受體2表達(dá)變化與腎小管、間質(zhì)損傷的相關(guān)性分析[J];臨床內(nèi)科雜志;2014年05期

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本文編號(hào)：2263273