【摘要】：[背景] 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)常見且嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,其患病率日益增加。流行病學(xué)調(diào)查顯示,DN已成為終末期腎病的主要病因,嚴(yán)重威脅人類健康。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未明確,而目前的治療手段僅能延緩卻未能阻斷DN進(jìn)展。因此,探索DN的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。 腎小球系膜細(xì)胞(Mesangial cells, MCs)是腎臟重要的固有細(xì)胞之一,具有維持腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)代謝平衡的重要作用。ECM合成與降解的平衡對維護(hù)組織器官穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在DN的發(fā)病機(jī)制中,葡萄糖毒性引起MCs功能障礙,ECM合成與降解失衡,膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等ECM成分在腎小球系膜區(qū)蓄積,最終導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張和腎小球硬化等DN主要的病理學(xué)改變。 Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I, Col-Ⅰ)是由MCs合成并分泌的一種主要的系膜ECM成分,也是DN晚期腎小球硬化的標(biāo)志產(chǎn)物。既往國外研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)MCs高表達(dá)并分泌Col-Ⅰ,與此同時Col-Ⅰ還能反作用于MCs,引起多種蛋白表達(dá)的變化及細(xì)胞凋亡。研究認(rèn)為高糖通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-(?)1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)等促進(jìn)MCs合成Col-Ⅰ;高糖還能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)降低MCs對系膜基質(zhì)中Col-Ⅰ的降解。最近國外研究發(fā)現(xiàn)另一種不同于MMPs的Col-Ⅰ降解途徑。 自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種依賴溶酶體降解異常細(xì)胞質(zhì)成分或受損細(xì)胞器的細(xì)胞內(nèi)降解途徑,對維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。目前大量研究證實(shí)自噬在多種生理、病理過程中的重要作用并與藥物性腎損傷、缺血再灌注腎損傷、腎臟衰老等腎臟疾病密切相關(guān),但是自噬在DN發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確。最近研究報(bào)道指出小鼠肺泡上皮細(xì)胞、大鼠心肌成纖維細(xì)胞等細(xì)胞能通過自噬降解Col-Ⅰ,可見自噬具有一定的抵抗組織器官纖維化的作用。還有研究發(fā)現(xiàn),DM患者和DM小鼠腎臟組織中的自噬水平明顯降低,高糖培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞的自噬水平也明顯降低。但是,自噬在葡萄糖毒性損傷MCs中的變化和功能仍不清楚。因此,我們假設(shè)高糖損傷MCs的自噬功能,MCs自噬抑制可能參與了DN的發(fā)生與發(fā)展,這可能是因?yàn)樽允删哂屑?xì)胞內(nèi)降解Col-Ⅰ、維護(hù)ECM代謝平衡的腎臟保護(hù)作用。 胰高血糖素樣肽(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是一種由腸道L細(xì)胞分泌的促進(jìn)胰島素分泌的肽類激素。GLP-1與GLP-1受體(GLP-1receptor, GLP-1R)結(jié)合后,通過促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素、抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素、抑制食欲、延緩胃排空等途徑降低血糖。Exendin-4是從美國西南部巨蜥蜴唾液中分離所得的GLP-1類似物,已被研發(fā)為長效GLP-1受體激動劑艾塞那肽用于治療2型糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4除了降低血糖、保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用以外,還具有保護(hù)腎臟的作用。在調(diào)節(jié)ECM代謝方面,Exendin-4具有逆轉(zhuǎn)高糖狀態(tài)下ECM合成與降解失衡的作用。目前,Exendin-4發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未研究透徹。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是真核生物中高度保守的能量感受器,廣泛表達(dá)于所有類型的腎臟細(xì)胞。AMPK還是調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡、自噬等多種生命過程的重要激酶,其磷酸化活性降低與DN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。我們研究證實(shí)Exendin-4通過激活A(yù)MPK信號通路改善由高糖誘導(dǎo)的大鼠MCs功能障礙。還有研究發(fā)現(xiàn)GLP-1和Exendin-4分別通過提高胰島β細(xì)胞、肝細(xì)胞的自噬水平抵抗葡萄糖、脂肪酸損傷細(xì)胞。但是,Exendin-4是否可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬功能保護(hù)MCs、維護(hù)ECM代謝平衡,國內(nèi)外均未見研究報(bào)道。因此,我們假設(shè)在高糖損傷MCs中,細(xì)胞自噬抑制與AMPK磷酸化活性降低有關(guān)；Exendin-4可能通過激活A(yù)MPK增強(qiáng)MCs自噬功能,減少高糖誘導(dǎo)的Col-Ⅰ蓄積。 關(guān)于MCs自噬在高糖誘導(dǎo)Col-Ⅰ蓄積中的作用以及Exendin-4對高糖刺激下MCs自噬功能的影響,目前國內(nèi)外暫無研究報(bào)道。研究并理解其中的細(xì)胞及分子機(jī)制,對于探索DN發(fā)病機(jī)制以及尋找新治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。因此,本課題以大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1作為研究對象,首先通過體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞觀察高糖對HBZY-1細(xì)胞自噬功能及細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ含量的影響,然后利用自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素探討MCs自噬在高糖誘導(dǎo)Col-Ⅰ蓄積中的作用,最后研究Exendin-4對高糖刺激下MCs自噬功能的影響和機(jī)制,旨在為DN的防治提供理論依據(jù)并尋找新思路。 本課題由以下兩個章節(jié)的研究組成： 第一章大鼠系膜細(xì)胞自噬在高糖誘導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白蓄積中的變化與作用 [目的] 1.觀察高糖對大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1自噬功能的影響； 2.觀察高糖對HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ含量的影響； 3.探討自噬在高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ蓄積中的作用。 [方法] 1.細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基,于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1. 2.實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組(NG組,5.6mmol/L D-葡萄糖)、高滲對照組(Man組,5.6mmol/L D-葡萄糖+24.4mmol/LD-甘露醇)、高糖組(HG組,30mmol/LD-葡萄糖)、雷帕霉素組(NG+R組,5.6mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L雷帕霉素)、高糖聯(lián)合雷帕霉素處理組(HG+R組,30mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L雷帕霉素)。 3.高糖條件培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,分別于Oh、12h、24h、36h、48h、72h提取細(xì)胞全蛋白,應(yīng)用免疫印跡法檢測高糖刺激不同時間點(diǎn)后HBZY-1細(xì)胞內(nèi)自噬體形成標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)或HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ的含量。 4.為了排除刺激時間與滲透壓對HBZY-1細(xì)胞自噬的影響,分三組(NG組、Man組及HG組)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,以高糖條件下HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)差異最顯著的時間點(diǎn)作為研究終點(diǎn),提取三組細(xì)胞總RNA及全蛋白；應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR法檢測三組細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7mRNA的相對表達(dá)量(2-△△口計(jì)算法)；應(yīng)用免疫印跡法檢測三組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1、自噬降解底物SQSTM1/P62蛋白的表達(dá),采用Quantity One4.5.2軟件進(jìn)行半定量分析,以管家基因編碼的β-actin蛋白作為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。 5.為了排除刺激時間與滲透壓對HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ含量的影響,分三組(NG組、Man組及HG組)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,以高糖條件下HBZY-1細(xì)胞Col-Ⅰ蛋白表達(dá)差異最顯著的時間點(diǎn)作為研究終點(diǎn),提取三組細(xì)胞全蛋白；應(yīng)用免疫印跡法,以管家基因編碼的β-actin蛋白作為內(nèi)參,半定量分析三組細(xì)胞Col-Ⅰ的相對表達(dá)量。 6.分四組(NG組、NG+R組、HG組、HG+R組)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,以高糖條件下HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ和Col-Ⅰ表達(dá)均有顯著差異的時間點(diǎn)作為研究終點(diǎn),提取四組細(xì)胞全蛋白；應(yīng)用免疫印跡法,以管家基因編碼的β-actin蛋白作為內(nèi)參,半定量分析四組細(xì)胞LC3-II和Col-Ⅰ的相對表達(dá)量。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),組間多重比較采用LSD法；若方差不齊時,采用Welch法近似方差分析進(jìn)行校正,組間多重比較采用Dunnett's T3法。P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞自噬體形成標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)量隨時間變化的特點(diǎn)： 高糖刺激HBZY-1細(xì)胞36小時(HG36h)后,LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量較HG Oh顯著降低(P=0.018),并隨著刺激時間延長逐漸降低(P0.01); HG72h HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量最低,與HG36h比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)。因此選用72小時作為研究高糖對HBZY-1細(xì)胞自噬功能影響的研究終點(diǎn)。 2.高糖對HBZY-1細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5mRNA、Atg7mRNA表達(dá)的影響： HG組HBZY-1細(xì)胞Atg5mRNA的表達(dá)量顯著降低,較NG組下調(diào)約3.5倍(P=0.022)；HG組HBZY-1細(xì)胞Atg7mRNA的表達(dá)量顯著降低,較NG組下調(diào)約2.5倍(P=0.011)；NG組與Man組HBZY-1細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5和Atg7的表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3.高糖對HBZY-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和自噬降解底物SQSTM1/p62表達(dá)的影響： HG組HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達(dá)量均較NG組顯著降低(P=0.019,P=0.012)；HG組HBZY-1細(xì)胞SQSTM1/p62蛋白的表達(dá)量較NG組顯著增加(P=0.000)；NG組與Man組HBZY-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和自噬降解底物SQSTM1/p62的表達(dá)均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 4.高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ含量隨時間變化的特點(diǎn)： 高糖刺激72小時(HG72h)后,HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ蛋白的含量較HG Oh顯著增多(P=0.000)；其它時間點(diǎn)HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ蛋白的含量與HG Oh比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。因此選用72小時作為研究高糖對HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ含量影響的研究終點(diǎn)。 5.高糖對HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ含量的影響： HG組HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ的含量顯著增高,是NG組的2倍(P=0.028)；NG組與Man組HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ的含量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 6.自噬激動劑雷帕霉素對HBZY-1細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ、Col-Ⅰ表達(dá)的影響： 與NG組相比,高糖組HBZY-1細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量顯著降低(P=0.004),Col-I的含量顯著增高(P=0.005)；與高糖組相比,給予雷帕霉素干預(yù)后(HG+R組)HBZY-1細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量顯著增高(P=0.039),Col-I的含量顯著降低(P=0.049)。 [結(jié)論] 1.高糖抑制HBZY-1細(xì)胞自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),其作用與滲透壓無關(guān)；可見,在DM狀態(tài)的腎臟中,葡萄糖毒性損傷了MCs的自噬功能。 2.高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-I蓄積,其作用與滲透壓無關(guān)。 3.在高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞內(nèi)Col-I蓄積中,自噬增強(qiáng)與Col-I減少有關(guān)。 4.MCs自噬可能參與降解高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的Col-I,減少Col-I蓄積,具有維護(hù)ECM代謝平衡的腎臟保護(hù)作用；高糖損傷MCs自噬功能則參與了DN發(fā)病和進(jìn)展。 第二章Exendin-4對高糖刺激下大鼠系膜細(xì)胞自噬的影響和機(jī)制 [目的] 1.觀察不同濃度Exendin-4對高糖刺激下HBZY-1細(xì)胞自噬功能的影響； 2.觀察高糖對AMPK磷酸化活性的影響及Exendin-4的干預(yù)作用； 3.探討Exendin-4干預(yù)高糖抑制HBZY-1細(xì)胞自噬的可能機(jī)制。 [方法] 1.細(xì)胞培養(yǎng)：同第一章。 2.實(shí)驗(yàn)分組：高糖組(HG組,30mmol/L D-葡萄糖)、高糖聯(lián)合lnmol/L Exendin-4組(HG+1nM Ex-4組,30mmol/L D-葡萄糖+1nmol/L Exendin-4).高糖聯(lián)合10nmol/L Exendin-4組(HG+10nM Ex-4組,30mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L Exendin-4).高糖聯(lián)合100nmol/L Exendin-4組(HG+100nM Ex-4組,30mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Exendin-4).正常對照組(NG組,5.6mmol/LD-葡萄糖)、10nmol/L Exendin-4組(NG+10nM Ex-4組,5.6mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L Exendin-4). 3.高糖、高糖聯(lián)合不同濃度(1.10.100nmol/L)Exendin-4培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,于72h提取各組細(xì)胞全蛋白,應(yīng)用免疫印跡法半定量分析四組細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的相對表達(dá)量。 4.分兩組(HG組、HG+10nM Ex-4組)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,分別于Oh、24h、36h、48h、72h提取細(xì)胞全蛋白,應(yīng)用免疫印跡法檢測各組HBZY-1細(xì)胞總AMPK (t-AMPK)和磷酸化AMPK (p-AMPK)蛋白的相對表達(dá)量。 5.分四組(NG組、NG+10nM Ex-4組、HG組、HG+lOnM Ex-4組)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,以高糖條件下HBZY-1細(xì)胞AMPK磷酸化蛋白表達(dá)差異最顯著的時間點(diǎn)作為研究終點(diǎn),提取四組細(xì)胞全蛋白,應(yīng)用免疫印跡法檢測四組細(xì)胞t-AMPK和p-AMPK蛋白的相對表達(dá)量。采用p-AMPK/t-AMPK比值表示AMPK磷酸化活性的水平。 6.分四組(NG組、NG+10nM Ex-4組、HG組、HG+10nM Ex-4組)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,于72h提取四組細(xì)胞全蛋白,應(yīng)用免疫印跡法檢測四組細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的相對表達(dá)量。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析Exendin-4濃度與HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量的關(guān)系,P0.05認(rèn)為雙變量存在相關(guān)關(guān)系。余同第一章。 [結(jié)果] 1.不同濃度Exendin-4對高糖刺激下HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響： 高糖聯(lián)合不同濃度Exendin-4處理的HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量均顯著高于HG組(P=0.000)；與%HG+1nM Ex-4組相比,HG+10nM Ex-4組和HG+100nMEx-4組HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量均顯著增高(P=0.001); HG+10nMEx-4組與HG+100nM Ex-4組HBZY-1細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.674)。Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示：高糖環(huán)境下,Exendin-4濃度與HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)=0.91,P=0.000)。 2.高糖刺激下HBZY-1細(xì)胞磷酸化AMPK蛋白表達(dá)量隨時間變化的特點(diǎn)及Exendin-4的干預(yù)作用： 高糖刺激下,HBZY-1細(xì)胞p-AMPK蛋白的表達(dá)量降低,其中HG36h和HG48hHBZY-1細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)量降低最明顯；給予10nmol/L Exendin-4干預(yù)后,高糖刺激的各時間點(diǎn)HBZY-1細(xì)胞p-AMPK蛋白的表達(dá)量相近并高于同時間點(diǎn)高糖組的表達(dá)量。 3.Exendin-4對HBZY-1細(xì)胞AMPK磷酸化活性的影響： HG組HBZY-1細(xì)胞AMPK磷酸化活性(p-AMPK/t-AMPK比值)較NG組顯著降低(P=0.005)；HG+10nM Ex-4組HBZY-1細(xì)胞AMPK磷酸化活性較HG組顯著增高(P=0.009)； 4.Exendin-4對HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響： HG組HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量較NG組顯著降低(P=0.000):HG+10nMEx-4組HBZY-1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量較HG組顯著增高(P=0.034)。 [結(jié)論] 1.Exendin-4呈濃度依賴性改善高糖刺激下HBZY-1細(xì)胞的自噬功能； 2.高糖抑制HBZY-1細(xì)胞AMPK磷酸化活性,Exendin-4可干預(yù)該抑制作用； 3.高糖刺激下HBZY-1細(xì)胞AMPK磷酸化活性降低與自噬抑制有關(guān),Exendin-4可能通過激活A(yù)MPK改善高糖刺激下HBZY-1細(xì)胞的自噬功能。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2241162