發(fā)布時(shí)間：2018-08-22 18:56

【摘要】：目的;腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性疾病之一,其中腎透明細(xì)胞癌是最主要的病理類型。以往研究表明VHL/HIF通路和rniRNA在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,而本課題旨在探尋這兩條經(jīng)典通路之間的關(guān)聯(lián)及其在腎透明細(xì)胞癌中的作用和機(jī)制。方法：1.通過VHL外顯子測(cè)序和VHL啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)分析檢測(cè)182例腎透明細(xì)胞癌組織中基因組DNA的VHL狀態(tài),并選取8例VHL野生型腎透明細(xì)胞癌組織與8例VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌組織配對(duì),通過微陣列分析兩組之間miRNA的表達(dá)差異,并通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證;通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)錄后生成過程中的關(guān)鍵酶Dicer、Drosha、Exportin-5和DGCR8在36例VHL野生型腎透明細(xì)胞癌組織和36例VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況,并通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相應(yīng)癌旁腎組織的Dicer表達(dá)情況;通過在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中分別過表達(dá)或敲低VHL后檢測(cè)Dicer的表達(dá)情況。2.通過線性回歸分析檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌組織中Dicer和HIF mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性,并通過在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中過表達(dá)和敲低Dicer后檢測(cè)HIF及其下游基因的表達(dá)情況;基于微陣列數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果,通過生物信息學(xué)軟件的分析找出與HIF-2a有潛在結(jié)合位點(diǎn)的由Dicer介導(dǎo)的miRNA,并通過實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該miRNA能否直接靶向作用于HIF-2α。3.通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、血管形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)探討Dicer在VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能以及是否通過HIF-2α發(fā)揮作用;對(duì)146例VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行隨訪,通過Kaplan-Meier法和COX回歸模型分析Dicer mRNA表達(dá)水平高低和臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：1.微陣列數(shù)據(jù)分析和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示VHL缺陷型較VHL野生型腎透明細(xì)胞癌組織中的總體miRNA表達(dá)是下調(diào)的,而下調(diào)miRNA的前體表達(dá)卻是上升的;miRNA轉(zhuǎn)錄后生成過程中的關(guān)鍵酶只有Dicer在VHL缺陷型中的表達(dá)較VHL野生型中的表達(dá)明顯下降,同時(shí)Dicer的表達(dá)水平在VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌組織中較癌旁組織明顯下調(diào),而Dicer在VHL野生型腎透明細(xì)胞癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平卻無明顯差異;在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中VHL可以正向調(diào)控Dicer的表達(dá)水平。2.線性回歸分析結(jié)果顯示Dicer與HIF-2a的mRNA表達(dá)水平成負(fù)相關(guān),與HIF-1a的mRNA表達(dá)水平無相關(guān)性;在VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中Dicer可以反向調(diào)控HIF-2a及其下游基因的表達(dá),同時(shí)HIF-2a是由Dicer介導(dǎo)的niR-182-5p的直接靶點(diǎn)。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)和血管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Dicer能在體外抑制VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌的增殖和血管生成,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Dicer也能在體內(nèi)抑制VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌的生長,而且Dicer的這一抑癌功能在某種程度上是通過下調(diào)HIF-2a實(shí)現(xiàn)的;Kaplan-Meier生存分析顯示在VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌患者中,Dicer mRNA低表達(dá)水平組的術(shù)后生存率較Dicer mRNA高表達(dá)水平組更差,COX回歸分析顯示Dicer mRNA低表達(dá)水平是術(shù)后生存率較低的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論：腎透明細(xì)胞癌中Dicer被VHL正向調(diào)控并能通過下調(diào)HIF-2a及其下游基因的表達(dá)來抑制VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌的腫瘤表型;Dicer的低表達(dá)是VHL缺陷型腎透明細(xì)胞癌患者臨床預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此,Dicer在未來有可能成為腎透明細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)的腫瘤標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn),為腎透明細(xì)胞癌的診斷和治療提供新的思路。
[Abstract]:Objective: Renal cell carcinoma (RCC) is one of the most common malignant diseases in the urinary system, and renal clear cell carcinoma (RCCC) is the most important pathological type.Previous studies have shown that the VHL/HIF pathway and rniRNA play an important role in the development of RCC. Methods: 1. The VHL status of genomic DNA in 182 cases of renal clear cell carcinoma was detected by VHL exon sequencing and VHL promoter region methylation analysis, and 8 cases of VHL wild type renal clear cell carcinoma and 8 cases of VHL deficient renal clear cell carcinoma were selected to pair with each other. Differential expression of iRNA was detected by real-time quantitative PCR and Western blot, and the expression of key enzymes Dicer, Drosha, Exportin-5 and DGCR8 in 36 VHL wild renal clear cell carcinoma tissues and 36 VHL deficient renal clear cell carcinoma tissues was detected by real-time quantitative PCR and Western blot. PCR was used to detect the expression of Dicer in the adjacent renal tissues. The expression of Dicer was detected by overexpressing or knocking down VHL in renal clear cell carcinoma cell lines. Dicer-mediated microRNAs with potential binding sites to HIF-2a were identified by bioinformatics software analysis based on microarray data and real-time quantitative PCR results. Real-time quantitative PCR, Western blot and luciferase assay were used to verify the direct targeting of the microRNAs. To investigate the biological function of Dicer in VHL-deficient renal clear cell carcinoma and whether it plays a role through HIF-2alpha through clone formation test, angiogenesis test and tumor formation test in nude mice; to follow up 146 patients with VHL-deficient renal clear cell carcinoma and analyze Dice by Kaplan-Meier method and COX regression model. Results: 1. Microarray data analysis and real-time quantitative PCR showed that the expression of total microRNAs in VHL deficient renal clear cell carcinoma was down-regulated compared with that in VHL wild type renal clear cell carcinoma, but the expression of precursors of down-regulated microRNAs was up-regulated. Dicer was the only key enzyme in the post-transcriptional production of microRNAs. The expression level of Dicer in VHL-deficient renal clear cell carcinoma was significantly lower than that in VHL-deficient renal clear cell carcinoma, but the expression level of Dicer in VHL-deficient renal clear cell carcinoma and its adjacent tissues was not significantly different. Linear regression analysis showed that Dicer was negatively correlated with the mRNA expression of HIF-2a, but not with the mRNA expression of HIF-1a; Dicer could reverse the expression of HIF-2a and its downstream genes in VHL-deficient renal clear cell carcinoma cell lines, and HIF-2a was Dicer-mediated niR-18. Direct target of 2-5p. 3. Cloning and angiogenesis assays confirmed that Dicer could inhibit the proliferation and angiogenesis of VHL-deficient clear cell renal cell carcinoma in vitro. Tumor formation assay in nude mice confirmed that Dicer could also inhibit the growth of VHL-deficient clear cell renal cell carcinoma in vivo, and Dicer's anti-tumor function to a certain extent is universal. Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival rate of patients with VHL-deficient renal clear cell carcinoma was worse in the group with low expression of Dicer mRNA than in the group with high expression of Dicer mRNA. COX regression analysis showed that low expression of Dicer mRNA was an independent risk factor for lower survival rate. Dicer is positively regulated by VHL and can inhibit the tumor phenotype of VHL-deficient renal clear cell carcinoma by down-regulating the expression of HIV-2a and its downstream genes. Low expression of Dicer is an independent risk factor for poor clinical prognosis in patients with VHL-deficient renal clear cell carcinoma. Grade I tumor markers and new therapeutic targets provide new ideas for the diagnosis and treatment of renal clear cell carcinoma.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2198011