本文選題：RNF138 + 基因敲除小鼠��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：精子發(fā)生是雄性生殖細(xì)胞受高度復(fù)雜調(diào)控的發(fā)育過程,包括三個(gè)重要階段：精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞變形。隨著核固縮,線粒體重排,過渡蛋白和魚精蛋白替換組蛋白,頂體形成等過程,最終形成具備傳遞父源遺傳信息能力的終末分化生殖細(xì)胞-成熟精子。小鼠和大鼠高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)表明精子發(fā)生過程需要大量的睪丸特異性表達(dá)基因參與調(diào)控。據(jù)估計(jì)在小鼠的基因組中,大約有4%的基因特異表達(dá)于精子發(fā)生過程的各個(gè)階段。RNF138,即RING (Really Interesting New Gene) Finger protein 138是本組前期在精子發(fā)生的研究工作中首先發(fā)現(xiàn)的含有RING Finger結(jié)構(gòu)域且具有E3泛素連接酶活性的蛋白質(zhì)。泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式,由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3在內(nèi)的一系列酶促反應(yīng)協(xié)同完成。大量的研究證實(shí),泛素化修飾除了參與蛋白質(zhì)降解,還與蛋白激酶的激活、膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA損傷修復(fù)和染色質(zhì)重塑等一系列細(xì)胞生理過程密切相關(guān)。一些哺乳動(dòng)物睪丸特異性表達(dá)的E3泛素連接酶在精子發(fā)生的不同階段執(zhí)行多種不同的生物學(xué)功能。其中一些E3泛素連接酶以及相關(guān)復(fù)合物在減數(shù)分裂過程早期的DNA雙鏈斷裂(DSB)和組蛋白修飾發(fā)揮重要作用。我們檢測(cè)了不同日齡小鼠睪丸組織RNF138蛋白質(zhì)表達(dá)水平,結(jié)果顯示RNF138的表達(dá)量隨睪丸發(fā)育階段的成熟而增加,在第一波生精波(5周)完成時(shí),開始趨于穩(wěn)定,顯示了其發(fā)育階段表達(dá)特異性。免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示RNF138在除精原細(xì)胞以外的各級(jí)生精細(xì)胞的胞漿均有不同程度的表達(dá),尤其在初級(jí)精母細(xì)胞表達(dá)最高,在這個(gè)階段初級(jí)精母細(xì)胞開始進(jìn)入減數(shù)第一次分裂,這也提示RNF138可能參與生精細(xì)胞的早期發(fā)育。為了深入研究RNF138對(duì)雄性生殖的功能,我們利用Cre-loxP或者Flp-FRT同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了Vasa-Cre條件性基因敲除小鼠動(dòng)物模型。結(jié)合RNF138基因敲除動(dòng)物模型表型分析,與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)RNF138基因條件性敲除小鼠各個(gè)發(fā)育階段的睪丸重量和精子數(shù)量顯著降低。形態(tài)學(xué)方面,RNF138基因敲除后早期的精子發(fā)生過程阻滯,早期部分生精細(xì)胞脫落,尤其是精母細(xì)胞數(shù)量顯著減少。TUNEL結(jié)果顯示精母細(xì)胞凋亡增加。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究中。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可以豐富和驗(yàn)證基因組數(shù)據(jù)的注釋,同時(shí)用于不同樣本間基因表達(dá)差異、可變剪接等的比較。大量且快速地充實(shí)樣本的遺傳數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)資源可有助于深入開展分子生物學(xué)機(jī)制研究。因此為了深入研究RNF138在雄性生殖中的作用機(jī)制,我們對(duì)條件性RNF138基因敲除小鼠睪丸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。差異表達(dá)基因共152個(gè),與對(duì)照比較表達(dá)上調(diào)基因共73個(gè),表達(dá)下調(diào)基因共79個(gè)。根據(jù)RNAseq差異表達(dá)基因分析,差異表達(dá)基因COG注釋顯示功能性分類中參與DNA復(fù)制,重組和修復(fù)的頻率最高,這些結(jié)果提示RNF138在DNA損傷修復(fù)應(yīng)答過程中參與重要功能。為了研究RNF138是否參與DNA損傷應(yīng)答,我們利用激光損傷細(xì)胞發(fā)現(xiàn)RNF138富集在DNA損傷部位,且與DNA損傷標(biāo)志γH2AX重疊。對(duì)RNF138進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)視顯示RNF138快速有效招募到激光誘導(dǎo)的DNA損傷位點(diǎn),而且這一過程依賴于RNF138的Zinc finger結(jié)構(gòu)域。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RNF138是ATM的底物,可以被ATM在Ser124位點(diǎn)磷酸化。我們發(fā)現(xiàn)敲低RNF138后影響同源重組相關(guān)修復(fù)蛋白R(shí)AD51在DNA損傷位點(diǎn)的招募,且同源重組修復(fù)的效率顯著降低。敲低RNF138后細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激非常敏感,且這一表型可以被野生型質(zhì)粒拯救,說明RNF138直接參與DNA損傷修復(fù)過程。為揭示這一機(jī)制我們利用優(yōu)化的TAP技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)RAD51D可以與RNF138相互作用,進(jìn)而調(diào)控AD51D募集到DNA損傷位點(diǎn)的穩(wěn)定性。另外我們對(duì)zinc finger結(jié)構(gòu)域蛋白CCCTC結(jié)合因子(CTCF)在DNA損傷的功能和機(jī)制進(jìn)行了探討和研究。CTCF通過結(jié)合DNA鏈,限定常染色體和異染色體DNA之間的邊界,調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。而CTCF在DNA損傷反應(yīng)中的功能尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)CTCF迅速招募DNA損傷位點(diǎn),這過程由鋅指結(jié)構(gòu)域和多聚ADP-核糖(PAR)介導(dǎo)。進(jìn)一步的分析表明,只有三個(gè)鋅指基序是識(shí)別PAR必需的。缺少這三個(gè)鋅指,CTCF仍然可以與DNA結(jié)合。此外,CTCF敲低細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激電離輻射敏感。另外IR誘導(dǎo)的DNA損傷IRIF大小受CTCF的調(diào)控。這些結(jié)果表明,CTCF參與調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)區(qū)域的邊界。
[Abstract]:In order to study the expression of RNF138 , it is estimated that RNF138 may be involved in the early development of spermatogenic cells . We find that RNF138 is a substrate of ATM and can be phosphorylated by ATM at Ser124 site . It is found that RNF138 can interact with RNF138 and regulate chromatin structure . In addition , CTCF is sensitive to DNA damage . In addition , CTCF is sensitive to DNA damage . In addition , CTCF is sensitive to DNA damage .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R697

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本文編號(hào)：2010656