本文選題：泌尿外科學(xué) + 睪丸間質(zhì)細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：1研究背景和目的 隨著科技進(jìn)步,人類壽命的延長(zhǎng),全世界已步入老齡化時(shí)代。老年人口的身心健康成為當(dāng)前普遍關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題。在泌尿外科的男科學(xué)范疇,男性更年期綜合征是熱點(diǎn)研究的方向之一。盡管學(xué)術(shù)界對(duì)男性更年期綜合征還有著診斷和治療上的爭(zhēng)議,但是雄性激素部分缺乏是男性更年期綜合征的重要原因之一已是無(wú)可爭(zhēng)辯的事實(shí)。隨著年齡增長(zhǎng),包括生殖器官在內(nèi)的全身器官系統(tǒng)都逐漸發(fā)生老年性退變,在男性則表現(xiàn)為睪丸逐漸萎縮,睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡,合成分泌雄激素的功能隨之衰減。目前,對(duì)男性更年期綜合征最主要的臨床治療手段是用化學(xué)合成的雄性激素進(jìn)行補(bǔ)充治療。由于人體長(zhǎng)期應(yīng)用化學(xué)合成的雄激素可引起多種不良反應(yīng),用藥安全性成為限制普及使用雄激素補(bǔ)充治療的瓶頸。因此探討開發(fā)生物源性雄激素補(bǔ)充治療、促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生等方面,為研究全新治療方法開拓了新思路。 睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布在曲細(xì)精管的疏松結(jié)締組織中。從青春期開始,睪丸間質(zhì)細(xì)胞受垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的間質(zhì)細(xì)胞刺激素(黃體生成素)的作用,能合成分泌雄性激素(睪酮)。睪酮被運(yùn)輸?shù)缴眢w各處的靶器官,通過(guò)與雄激素受體結(jié)合發(fā)揮重要的生理作用,如促進(jìn)精子的發(fā)生和男性生殖器官發(fā)育,以及維持第二性征和性功能。 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因j'(bFGF)廣泛存在于腦、垂體、肝、腎、骨、軟骨、角質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、星形細(xì)胞等組織中,能促進(jìn)來(lái)源于中胚層及神經(jīng)外胚層的細(xì)胞增殖、分化并調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。有研究表明,該因子可促進(jìn)血管生成、創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)與再生以及胚胎的發(fā)育與分化。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)主要由人肝細(xì)胞合成和分泌,對(duì)胚胎分化、個(gè)體發(fā)育、糖及脂肪代謝起著重要調(diào)節(jié)作用。男性生殖系統(tǒng)來(lái)源于中胚層,bFGF和IGF1對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分化、增殖及其再生的調(diào)節(jié)作用等方面的研究卻鮮見報(bào)道。 本論文所敘述的研究是利用對(duì)成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性抑制劑——乙烷二甲烷硫砜(EDS)使大鼠的成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡,構(gòu)建活體動(dòng)物模型及體外培養(yǎng)的曲細(xì)精管模型,并利用該模型系統(tǒng)地研究bFGF和IGF1對(duì)成年大鼠LC的再生、分化、增殖作用,以闡明其分子機(jī)制,為開展對(duì)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化進(jìn)而促使睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生的方法治療男性更年期綜合征提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 根據(jù)研究目的,把實(shí)驗(yàn)分成以下3個(gè)部分：(1)構(gòu)建大鼠ALC敲除(knock-out)模型。分別從活體大鼠和體外培養(yǎng)的兩個(gè)方面構(gòu)建(2)研究 和IGF1對(duì)活體大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及睪酮分泌的影響。bFGF(3)研究 和IGF1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠曲細(xì)精管中睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及bFGF睪酮分泌的影響。2研究方法 2.1構(gòu)建曲細(xì)精管活體大鼠AL敲除(knock-out)模型 將3月齡SD雄性大鼠共35只,隨機(jī)分成3個(gè)組：11只為空白對(duì)照組、11 只為溶劑對(duì)照組、11只為EDS處理組�？瞻讓�(duì)照組不做任何處理,溶劑對(duì)照組給予腹腔注射配制EDS溶液的溶劑與超純水的混合液),EDS組按75(DMSO的劑量予腹腔注射mg/kg處理后的第1、2、3、4、5、6、7天每組EDS。EDS處死1只大鼠,在上述各時(shí)間點(diǎn)抽取大鼠的血液,用放射免疫(RIA)法測(cè)定大鼠血清中睪酮含量。EDS處理后的14、21、35、56d,各組分別處死1只大鼠。提取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠睪丸標(biāo)本制作大鼠睪丸病理切片進(jìn)行HE染色和3β-HSD以及11p-HSDl免疫組化染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)。 2.2構(gòu)建體外培養(yǎng)的大鼠曲細(xì)精管ALC敲除模型 按75mg/kg的劑量予3月齡SD雄性大鼠腹腔注EDS,7d后用CO2窒息法處死。然后在無(wú)菌條件下取出睪丸,經(jīng)D-PBS漂洗,用剪刀去睪丸被膜,將其置于含冷凍PBS的培養(yǎng)皿中。用無(wú)齒鑷子分離開曲細(xì)精管,去除周圍附著的所有血管組織和雜細(xì)胞,并用PBS及DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗數(shù)次,然后放入34℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基的不同,將樣品分為ITS組和ITS+LH組,加入試劑培養(yǎng)28d后，每隔3.5d更換1次培養(yǎng)基,取1次上清液,用放射免疫(RIA)法測(cè)量上清液的睪酮含量。 2.3bFGF和IGF1對(duì)活體大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及睪酮分泌的影響 將3月齡雄性SD大鼠140只進(jìn)行完全隨機(jī)分組：空白對(duì)照組20只、溶劑對(duì)照組20只、EDS處理組100只；EDS處理組又分為bFGF組20只、FGFR抑制劑(PD166866)組20只、IGF1組20只、IGFR抑制劑(PPP)組20只、生理鹽水組20只。 空白對(duì)照組不做任何處理,溶劑對(duì)照組給予注射配制EDS的溶劑(DMSO與超純水的混合液),EDS組的大鼠按75mg/kg的劑量腹腔注射EDS溶液1次。在EDS單次腹腔注射后從第7天開始,進(jìn)行不同細(xì)胞因子的處理。其中bFGF組是按照100μg·kg-1·d-1的劑量做bFGF腹腔注射,每日1次,共7d；PD166866組按照100μg·kg-1·d-1的劑量做PD166866腹腔注射,每日1次,共7d；IGF1組是按照100μg·kg-1·d-1的劑量做IGF1腹腔注射,每日1次,共7d；PPP組按照100μg·kg-1·d-1的劑量做PPP腹腔注射,每日1次,共7d；生理鹽水組是按照0.6mL·kg-1·d-1的劑量腹腔注射生理鹽水,每日1次,共7d。根據(jù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖分化代表的不同時(shí)間點(diǎn),在EDS注射后第14、21、35、56天麻醉分別處死每組大鼠,取出肝臟、腎臟、雙側(cè)睪丸并測(cè)量質(zhì)量；抽取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血液用放射免疫(RIA)法測(cè)定大鼠血清中卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)含量；提取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠睪丸標(biāo)本,分別做：(1)制作病理切片,并進(jìn)行HE染色、進(jìn)行LHR免疫組化SABC染色；(2)提取睪丸組織總蛋白,用Western Blot法檢測(cè)睪酮合成關(guān)鍵限速酶類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的表達(dá)量。 2.4bFGF和IGFI對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠曲細(xì)精管中睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及睪酮分泌的影響 先做好EDS處理后大鼠曲細(xì)精管體外培養(yǎng)模型,分成ITS組(對(duì)照組)、LH組、bFGF組和IGF1組。對(duì)照組不做因子處理,其余按組別加入LH和200、100、10ng/mL3種不同質(zhì)量濃度的bFGF和IGF1進(jìn)行處理,然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)： (1)SLC增殖實(shí)驗(yàn)：24h后用EdU熒光標(biāo)記后觀察細(xì)胞增殖的圖像并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量,以檢測(cè)bFGF和IGF1對(duì)SLC的促增殖作用； (2)SLC分化實(shí)驗(yàn)：用同樣的因子處理方式培養(yǎng)72h,至14d和21d時(shí)從樣品中收集上清液,用放射性免疫方法測(cè)定培養(yǎng)上清中睪酮含量；從曲細(xì)精管樣品中提取RNA,用Q-PCR方法測(cè)定LC雄激素合成通路各個(gè)關(guān)鍵酶RNA表達(dá)情況；從曲細(xì)精管樣品中提取蛋白質(zhì),用Western-Blot方法測(cè)定LC雄激素合成通路各個(gè)關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)對(duì)曲細(xì)精管樣品做3p-HSD染色并觀察染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從上述幾個(gè)方面評(píng)估bFGF和IGF1對(duì)大鼠SLC的誘導(dǎo)分化功能。 2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算各組平均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s,數(shù)據(jù)表示為x±s。驗(yàn)證EDS對(duì)活體大鼠ALC影響時(shí),使用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的Two-way ANOVA分析；驗(yàn)證離體培養(yǎng)曲細(xì)精管模型時(shí)使用重復(fù)測(cè)量的方差分析,先進(jìn)行Mauchly球形檢驗(yàn),若P0.05,滿足球形假設(shè),無(wú)需校正；若P0.05,則不滿足球形假設(shè),需用ε校正系數(shù)來(lái)校正自由度,本實(shí)驗(yàn)采用Greenhouse-Geisser校正的結(jié)果。多組單因素均數(shù)間比較采用One-way ANOVA分析,先檢驗(yàn)方差齊性,若P≥-0.05,選擇基于方差齊同的方差分析結(jié)果,若P0.05,選擇基于方差不齊的方差分析結(jié)果。方差齊同者選擇Bonferronl法比較,方差不齊者采用Tamhane's T2法比較。P0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3結(jié)果及分析 3.1大鼠ALC敲除模型的構(gòu)建 對(duì)比空白對(duì)照組和EDS處理后1-4d以及14、21、35、56d的大鼠睪丸切片HE染色劑及3β-HSD、11β-HSD1染色和免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)：EDS處理后第1天,睪丸間質(zhì)細(xì)胞大量減少,持續(xù)大約7-14d,此后睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。第21天可在睪丸間質(zhì)中檢測(cè)到3β-HSD以及11β-HSD1被染色的細(xì)胞。檢測(cè)EDS處理1-7d的大鼠血清睪酮含量,與空白對(duì)照組比較,發(fā)現(xiàn)睪酮含量急劇下降。對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的雙因素方差分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1-7d時(shí)間段影響睪酮下降的主要因素是分組因素,即對(duì)大鼠進(jìn)行了EDS處理(F=79.902,P=0.000),而溶解EDS的溶劑的影響因素可以忽略不計(jì),時(shí)間因素則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.795,P=0.591)。 分離已被敲除ALC大鼠的曲細(xì)精管,經(jīng)過(guò)ITS和ITS+LH培養(yǎng)28d后,在培養(yǎng)基的上清液中均可檢測(cè)出睪酮,在兩種培養(yǎng)基中,睪酮的含量呈現(xiàn)先增加后減少的峰值模式,LH處理組檢測(cè)出睪酮含量較ITS高。把兩種培養(yǎng)方式28-49d測(cè)得的上清液睪酮含量,用重復(fù)測(cè)量的方差分析,結(jié)果說(shuō)明時(shí)間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13229.399,P=0.000)；分組效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1815.516,P=0.000)；時(shí)間與處理方式交互效應(yīng)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4677.716,P=0.000),說(shuō)明在ITS組與ITS+LH組,睪酮含量隨時(shí)間變化而發(fā)生改變,睪酮含量變化也與處理因素有關(guān),即培養(yǎng)基中使用LH可增加睪酮含量。 3.2bFGF和IGF1對(duì)活體大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及睪酮分泌的影響 (1)不同處理組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠重要器官及血清FSH、T含量的影響如下： EDS單次腹腔注射后,大鼠各組間肝臟質(zhì)量差異有顯著性的是14d(F=13.822,P=0.000)、21d (F=9.427,P=0.000)、35d (F=3.907, P=0.006)和56d (F=65.112,P=0.000)。 EDS單次腹腔注射后大鼠各組間雙側(cè)腎臟質(zhì)量差異沒有顯著性的是14d(F=13.822,P=0.000)、21d(F=0.801,P=0.577)和35d (F=2.191,P=0.074);有顯著差異的是56d(F=26.927,P=0.000)。 EDS單次腹腔注射后大鼠各組間雙側(cè)睪丸質(zhì)量差異有顯著性的是14d(F=31.864,P=0.000)、21d (F=14.640, P=0.000)、35d (F=22.190,P=0.000)和56d(F=13.965,P=0.000)。 EDS單次腹腔注射后大鼠各組間血清FSH含量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)顯著性的是4d(F=1.207,P=0.332);21d(F=1.471, P=0.224);35d(F=2.259, P=0.067);56d (F=2.260,P=0.066)。 EDS單次腹腔注射后大鼠各組間血清睪酮含量差異有顯著性的是14d(F=4.731,P=0.002)、21d (F=4.131,P=0.004),35d(F=28.781, P=0.000)和56d (F=26.678,P=0.000)。 (2)對(duì)上述各指標(biāo)差異有顯著性的時(shí)間點(diǎn)再做進(jìn)一步組間比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)。 溶劑組的大鼠肝臟、雙腎、雙側(cè)睪丸、血清FSH和T含量與空白對(duì)照組比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 EDS處理后14d,生理鹽水組的肝臟質(zhì)量、雙側(cè)睪丸質(zhì)量均低于空白對(duì)照組組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；bFGF組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量高于生理鹽水組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 EDS處理后21d,生理鹽水組的肝臟質(zhì)量低于空白對(duì)照組,IGF1組的肝臟質(zhì)量高于其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。生理鹽水組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量低于空白對(duì)照組,bFGF組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量高于生理鹽水組和其抑制劑PD166866組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 EDS處理后35d,生理鹽水組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量低于空白對(duì)照組,bFGF組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量高于生理鹽水組和其抑制劑PD166866組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。bFGF組的血清T含量高于生理鹽水組、其抑制劑PD166866組和IGF1組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 EDS處理后56d,生理鹽水組的肝臟質(zhì)量低于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；生理鹽水組的雙側(cè)腎臟質(zhì)量低于空白對(duì)照組,IGF1組的雙側(cè)腎臟質(zhì)量高于生理鹽水組、bFGF組和其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); bFGF組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量與生理鹽水組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但高于其受體抑制劑PD166866組,IGF1組的雙側(cè)睪丸質(zhì)量高于其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); bFGF組和IGF1組的血清T含量都高于生理鹽水組,bFGF組的血清T含量高于其受體抑制劑PD166866組,IGF1組的血清T含量高于其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (3)不同處理組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響。 通過(guò)石蠟切片HE染色觀察,EDS注射從14d開始,睪丸間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)再生和增多,直至56d時(shí)出現(xiàn)成熟的睪丸間質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)對(duì)睪丸切片的LHR染色發(fā)現(xiàn),睪丸間質(zhì)中LHR染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)有同樣的再生和增多的情形。bFGF組和IGF1組對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增多的效應(yīng)高于生意鹽水組,也高于它們各自的受體抑制劑組。 (4)不同處理組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠睪丸StAR蛋白表達(dá)量的影響。 EDS單次腹腔注射后大鼠各組間睪丸StAR蛋白表達(dá)量差異有顯著性的是14d (F=1229.996, P=0.000)、21d (F=108.672, P=0.000)、35d (F=191.784,P=-0.000)和56d(F=9.624,P=0.000)。再做進(jìn)一步組間比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)： EDS處理后14、15d, bFGF組的睪丸StAR蛋白表達(dá)量高于生理鹽水組、其受體抑制劑PD166866組和IGF1組,IGF1組的睪丸StAR蛋白表達(dá)量高于生理鹽水組、其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); EDS處理后第35天,bFGF組的睪丸StAR蛋白表達(dá)量高于生理鹽水組、其受體抑制劑PD166866組和IGF1組,IGF1組的睪丸StAR蛋白表達(dá)量高于其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); EDS處理后第56天,IGF1組的睪丸StAR蛋白表達(dá)量高于生理鹽水組、其受體抑制劑PPP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.3bFGF和IGF1對(duì)體外培養(yǎng)大鼠曲細(xì)精管SLC再生、分化及睪酮分泌的影響 1)SLC增殖實(shí)驗(yàn)。 將LH以及3種不同質(zhì)量濃度的bFGF、IGF1作用于體外培養(yǎng)的大鼠曲細(xì)精管后,檢測(cè)EdU染色的細(xì)胞數(shù)量,與對(duì)照組(ITS組)比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度的細(xì)胞因子作用24h后,各處理組曲細(xì)精管上EdU染色的細(xì)胞數(shù)量之間差異有顯著性(F=5238.932,P=0.000)。對(duì)不同處理組做組間比較后發(fā)現(xiàn)：所有組別曲細(xì)精管上EdU染色的細(xì)胞數(shù)量均高于ITS組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；LH組細(xì)精管上EdU染色的細(xì)胞數(shù)高于質(zhì)量濃度為100、10ng/mL的IGF1組,但低于質(zhì)量濃度為200ng/mL的bFGF組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；質(zhì)量濃度為200ng/mL的IGF1組曲細(xì)精管上EdU染色的細(xì)胞數(shù)量高于質(zhì)量濃度為100和10ng/mL的IGF1組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；質(zhì)量濃度為200ng/mL的bFGF組曲細(xì)精管上EdU染色的細(xì)胞數(shù)量高于質(zhì)量濃度為100和10ng/mL的bFGF組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2)SLC分化實(shí)驗(yàn)。 不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞因子作用21d后,各處理組曲細(xì)精管培養(yǎng)基上清液中睪酮含量之間差異有非常顯著性(F=77.888,P=0.000)。對(duì)各處理組做組間比較后發(fā)現(xiàn)：LH組、質(zhì)量濃度為100ng/mL的IGFl組、質(zhì)量濃度為100ng/mL的bFGF組上清液中睪酮含量高于ITS組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；質(zhì)量濃度為200、10ng/mL的IGF1組上清液中睪酮含量低于LH組,質(zhì)量濃度為100ng/mL的IGF1組上清液中睪酮含量高于LH組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；質(zhì)量濃度為100ng/mL的IGF1組上清液中睪酮含量高于質(zhì)量濃度為200和10ng/mL的IGF1組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；質(zhì)量濃度為100ng/mL的bFGF組上清液中睪酮含量高于濃度為200和10ng/mL的bFGF組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 從曲細(xì)精管樣品中檢測(cè)LC雄激素合成通路各個(gè)關(guān)鍵酶RNA的表達(dá),用Western-Blot方法測(cè)定LC雄激素合成通路各個(gè)關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)對(duì)曲細(xì)精管樣品做3β-HSD染色并觀察染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù),結(jié)果得到同樣的驗(yàn)證。 4討論 4.1成功構(gòu)建活體大鼠ALC敲除模型和體外培養(yǎng)的曲細(xì)精管ALC敲除模型 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,將EDS對(duì)大鼠進(jìn)行單次腹腔注射后,該藥物可以選擇性誘導(dǎo)大鼠睪丸中ALC凋亡,因而顯著降低大鼠血清中睪酮的水平。這個(gè)過(guò)程從注射EDS第1天即開始,并持續(xù)7～14d。ALC被敲除后,曲細(xì)精管表面的SLC可以重新增殖并向ALC分化。在分化的過(guò)程中,新生的LC也可以表達(dá)合成雄激素的酶,成熟的ALC可以合成睪酮。整個(gè)ALC再生以及分泌雄激素的過(guò)程持續(xù)約56d,與青春期ALC的增殖分化過(guò)程相似。因此證明活體大鼠ALC敲除模型構(gòu)建成功。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,將EDS處理后7d的大鼠曲細(xì)精管進(jìn)行體外培養(yǎng),使用ITS培養(yǎng)基和添加LH后,均可以在培養(yǎng)基上清液中測(cè)出睪酮。28-63d,睪酮值呈現(xiàn)先增加,后減少的峰值模式,ITS+LH組培養(yǎng)基上清液中的睪酮含量較ITS組顯著增高。結(jié)果說(shuō)明,EDS對(duì)曲細(xì)精管表面SLC沒有影響,SLC可以增值并向ALC分化。外源性因子LH可以誘導(dǎo)SLC的增殖,并最終形成具合成和分泌睪酮能力的ALC。因此證明體外培養(yǎng)的成年大鼠曲細(xì)精管ALC敲除模型構(gòu)建成功。 利用這兩種模型可以進(jìn)行生長(zhǎng)因子及其受體抑制劑對(duì)SLC增殖和分化的影響,可以從分子層面研究其作用機(jī)理,為PADAM患者的新型治療方法提供理論依據(jù)。 4.2bFGF和IGF1對(duì)活體大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及睪酮分泌的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,除對(duì)睪丸的質(zhì)量和睪酮分泌有影響外,EDS的作用同時(shí)也會(huì)引起肝臟、腎臟等重要器官質(zhì)量的下降,而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)也沒有恢復(fù)的跡象。而肝臟、腎臟質(zhì)量的減少是否也可能跟細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān),仍需待進(jìn)一步的研究證實(shí)。bFGF和IGF1對(duì)肝臟質(zhì)量、雙腎質(zhì)量的恢復(fù)無(wú)明顯作用,EDS、bFGF、FGFR1/2特異性抑制劑PD166866、IGF1、IGFR和特異性抑制劑PPP對(duì)FSH的分泌無(wú)明顯影響。 通過(guò)睪丸的病理切片及LHR免疫組化檢查可發(fā)現(xiàn),bFGF是通過(guò)促進(jìn)睪丸實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加從而增加睪丸的質(zhì)量。IGF1組的促細(xì)胞增殖作用沒有bFGF組顯著。在EDS處理第14、21d時(shí),雖然睪丸的質(zhì)量已經(jīng)上升,但睪酮的含量尚未恢復(fù),這說(shuō)明bFGF在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)雖然已促進(jìn)SLC分化,但特有的類固醇合成細(xì)胞分子標(biāo)志以及睪酮合成酶系尚相對(duì)不足,導(dǎo)致睪酮合成能力還未完全恢復(fù),但是它們卻為SLC向ILC、ALC階段分化做足了儲(chǔ)備。因此bFGF組到了第35、56天,IGF1組要到第56天,睪酮合成能力才出現(xiàn)顯著上升。由于ALC是產(chǎn)生睪酮的主要細(xì)胞,遂可以推斷bFGF和IGF1均可促進(jìn)大鼠睪丸中ALC數(shù)量增殖。PD166866和PPP對(duì)促SLC增殖、分化有一定的抑制作用,但2種因子和受體之間的相互作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。受體抑制劑可能只是減緩LC的分化速度,但并不會(huì)完全抑制SLC向ALC的發(fā)育。 與生理鹽水組比較,bFGF組的睪丸質(zhì)量在14、21、35d顯著上升,而56d時(shí),睪丸質(zhì)量無(wú)明顯差異；對(duì)睪丸StAR蛋白的影響也出現(xiàn)同樣的效應(yīng),這說(shuō)明bFGF對(duì)LC的促增殖、分化的作用主要在SLC-PLC-ILC階段,對(duì)已經(jīng)分化成熟的ALC的作用不顯著。 4.3bFGF和IGF1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠曲細(xì)精管中睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生及睪酮分泌的影響 EDS對(duì)SLC沒有影響。外源性因子如LH可以誘導(dǎo)SLC的增殖,并最終形成具合成和分泌睪酮能力的ALC。EDS、ITS和LH是構(gòu)建在離體培養(yǎng)的大鼠曲細(xì)精管模型必不可少的試劑。這些分離好的曲細(xì)精管中的管周細(xì)胞及支持細(xì)胞可以在DMEM培養(yǎng)基中存活最長(zhǎng)150do將ALC敲除后,我們能在正常條件下將曲細(xì)精管表面的SLC誘導(dǎo)分化成ALC。重新生成的ALC可以表達(dá)3β-HSD陽(yáng)性及產(chǎn)生和分泌睪酮。bFGF和IGF1能夠促進(jìn)曲細(xì)精管上包括SLC在內(nèi)多種細(xì)胞的增殖,促增殖的能力與細(xì)胞因子的濃度呈正比；bFGF和IGF1能夠促進(jìn)EDS處理大鼠的睪酮分泌,增加StAR蛋白表達(dá),說(shuō)明bFGF和IGF1可誘導(dǎo)SLC向LC細(xì)胞系方向分化。但較高質(zhì)量濃度的bFGF和IGF1反而會(huì)抑制睪酮的生成,bFGF的作用明顯高于IGF1。 本研究為PADAM患者在于細(xì)胞治療方面提供了新的方向,同時(shí)也擴(kuò)大了細(xì)胞因子的臨床應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R697.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1981601