發(fā)布時間：2018-06-04 12:34

  本文選題：O-GlcNAc糖基化 + 細(xì)胞自噬��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景與目的:O-Glc NAc糖基化是一種動態(tài)的蛋白質(zhì)修飾過程,其廣泛參與細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動,越來越多的證據(jù)表明O-Glc NAc糖基化的異常修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),而O-Glc NAc糖基化在膀胱癌中的作用與機(jī)制,尚未見報道。自噬是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過程,其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中也發(fā)揮著重要作用。自噬作為細(xì)胞的一種重要的生理活動,受營養(yǎng)狀態(tài)(包括O-Glc NAc糖基化)等多個應(yīng)激因素調(diào)節(jié),因此我們推測O-Glc NAc糖基化通過調(diào)節(jié)自噬而在膀胱癌中發(fā)揮作用。本實驗旨在研究膀胱癌中O-Glc NAc糖基化對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用,以及O-Glc NAc糖基化調(diào)節(jié)自噬的具體分子機(jī)制,并闡明O-Glc NAc糖基化修飾對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,從而為膀胱癌的基礎(chǔ)研究提供新的視點,也為臨床治療膀胱癌提供新的思路。研究方法:1、選取人膀胱癌細(xì)胞株5637、RT4,分別使用O-Glc NAc糖基化抑制劑、O-Glc NAc糖基化增強(qiáng)劑及PBS處理細(xì)胞,檢測細(xì)胞自噬的變化。檢測指標(biāo)包括熒光顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)量,Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。2、構(gòu)建并篩選出5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株,RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和RT4-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株,5637-GFP-LC3/CTRL、5637-GFP-LC3/OGA-OE和5637-GFP-LC3/OGT-OE細(xì)胞株,熒光顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)量,Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。3、利用上述細(xì)胞株,使用不同方法調(diào)節(jié)細(xì)胞O-Glc NAc糖基化,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),初步選出O-Glc NAc糖基化的靶蛋白。構(gòu)建目的基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。IV4、利用上述細(xì)胞株,通過免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和Western blot實驗,檢測O-Glc NAc糖基化直接作用的靶蛋白。5、使用基因敲除和基因過表達(dá)的方法調(diào)節(jié)目的基因,Western blot檢測O-Glc NAc糖基化及相關(guān)蛋白的表達(dá)。6、體外實驗:調(diào)節(jié)5637、RT4細(xì)胞O-Glc NAc糖基化,檢測細(xì)胞生物學(xué)活性的變化,包括:MTT和平板克隆形成能力檢測細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;劃痕實驗和Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。7、體內(nèi)實驗:將5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株,RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和RT4-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株分別皮下接種裸鼠,觀察裸鼠及腫瘤生長情況,免疫組化檢測腫瘤中糖基化、自噬等相關(guān)基因表達(dá),同時關(guān)注肝、肺等轉(zhuǎn)移情況。研究結(jié)果:1、使用O-Glc NAc糖基化抑制劑處理膀胱癌細(xì)胞5637、RT4后,熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬增加,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的增加;反之,使用O-Glc NAc糖基化增強(qiáng)劑處理膀胱癌細(xì)胞5637、RT4后,熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬減少,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的減少。2、使用基因修飾的方法抑制細(xì)胞O-Glc NAc糖基化,熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬增加,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的增加;反之,使用基因修飾的方法增強(qiáng)細(xì)胞O-Glc NAc糖基化,熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬減少,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的減少。3、將自噬相關(guān)基因ULK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞株,Western blot檢測到ULK1尤其是p-ULK1(S555)在細(xì)胞自噬中起重要作用。使用不同方法調(diào)節(jié)細(xì)胞O-Glc NAc糖基化,Western blot檢測到p-ULK1(S555)的變化。4、使用不同方法調(diào)節(jié)細(xì)胞O-Glc NAc糖基化,Western blot檢測發(fā)現(xiàn):O-Glc NAc糖基化降低后,AMPK活性增加,ULK1活性增加,細(xì)胞自噬增強(qiáng);反之,O-Glc NAc糖基化增加后,AMPK活性降低,ULK1活性降低,細(xì)胞自噬減弱。Co-IP實驗顯示:O-Glc NAc糖基化直接對AMPK修飾而發(fā)揮作用。5、成功構(gòu)建AMPK缺失和過表達(dá)的細(xì)胞株,Western blot檢測到:p-ULK1(S555)的表達(dá)受AMPK調(diào)控,在AMPK缺如的情況下O-Glc NAc糖基化變化未引起p-ULK1(S555)的改變。6、MTT和平板克隆形成實驗示:低O-Glc NAc糖基化導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞增殖活力降低,高O-Glc NAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn):低O-Glc NAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞G1期增加,G2/M期減少;高O-Glc NAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞G1期減少,G2/M期增加。細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室檢測示:低O-Glc NAc糖基化導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力下降,高O-Glc NAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。7、裸鼠皮下成瘤實驗示:與對照相比,低O-Glc NAc糖基化組皮下移植瘤的體積和重量下降,高O-Glc NAc糖基化組皮下移植瘤的體積和重量增加;低O-Glc NAc糖基化組中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移下降,高O-Glc NAc糖基化組中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移增加。另外,免疫熒光證實低O-Glc NAc糖基化組中自噬增加,高O-Glc NAc糖基化組中自噬減少。研究結(jié)論:1、膀胱癌細(xì)胞中O-Glc NAc糖基化降低后,細(xì)胞自噬流增加;反之,O-Glc NAc糖基化增加后,細(xì)胞自噬流減少。即膀胱癌細(xì)胞中O-Glc NAc糖基化反向調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。2、自噬相關(guān)基因ULK1在自噬過程中起重要作用。膀胱癌細(xì)胞中O-Glc NAc糖基化降低后,AMPK活性增加,ULK1活性增加,細(xì)胞自噬增強(qiáng);反之,O-Glc NAc糖基化增加后,AMPK活性降低,ULK1活性降低,細(xì)胞自噬減弱。即O-Glc NAc糖基化通過AMPK途徑調(diào)節(jié)ULK1活性,而對細(xì)胞自噬產(chǎn)生影響。3、體外和體內(nèi)實驗證實O-Glc NAc糖基化對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生明顯的影響:低O-Glc NAc糖基化抑制膀胱癌細(xì)胞增殖活力,高O-Glc NAc糖基化增強(qiáng)細(xì)胞增殖活力;低O-Glc NAc糖基化抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力,高O-Glc NAc糖基化增強(qiáng)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力。
[Abstract]:The effects of O - Glc nac glycosylation on cell autophagy and the mechanism of O - Glc nac glycosylation in bladder cancer were studied . The expression of autophagy - related protein was detected by Western blot . Western blot analysis showed that the expression of O - Glc nac glycosylation led to decreased proliferation of bladder cancer cells , decreased activity of ULK1 and decreased cell autophagy . The results showed that low O - Glc nac glycosylation resulted in decreased proliferation activity of bladder cancer cells , decreased activity of ULK1 and decreased cell autophagy . In vitro and in vivo experiments prove that the O - Glc nac glycosylation inhibits the proliferation of bladder cancer cells , the high O - Glc nac glycosylation enhances the proliferation activity of bladder cancer cells , the low O - Glc nac glycosylation inhibits the proliferation of bladder cancer cells , the high O - Glc nac glycosylation inhibits the invasion and metastasis of bladder cancer cells , and the high O - Glc nac glycosylation enhances the invasion and metastasis ability of the bladder cancer cells .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.14

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本文編號：1977371