本文選題：β-甘油磷酸 + 血管平滑肌肌細胞　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 高磷是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者血管中膜鈣化的一個獨立危險因素，可引起心血管事件等嚴重并發(fā)癥，其誘導(dǎo)鈣化的機制可能是通過血管平滑肌細胞（VSMC）膜上的Ⅲ型鈉磷轉(zhuǎn)運體（Pit-1）進入細胞內(nèi)，引起VSMCs表型轉(zhuǎn)化而發(fā)生鈣化。進一步研究顯示鎂離子既可以抑制Pit-1通道活性而減少磷向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，又可以競爭性地拮抗細胞內(nèi)的磷，對細胞內(nèi)的磷水平的調(diào)節(jié)起一定的作用，但鎂離子與血管平滑肌細胞鈣化的關(guān)系目前尚不清楚。本研究旨在通過高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化模型來探討鎂離子和VSMCs鈣化兩者之間的關(guān)系，以明確鎂離子在VSMCs鈣化中的作用。 方法： 1VSMCs原代培養(yǎng) 運用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)獲取VSMCs，進行形態(tài)學(xué)及免疫細胞鑒定，并繪制正常平滑肌細胞生長曲線。 2實驗分組及處理 VSMCs隨機分為陰性對照組、高磷組及鎂干預(yù)組，陰性對照組采用低糖DMEM含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基，高磷組在正常培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10mmol/L β-甘油磷酸制成高磷培養(yǎng)基，鎂干預(yù)組在上述高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入氯化鎂，使鎂離子的終濃度分別為1mmol/L（鎂干預(yù)組1）、2mmol/L（鎂干預(yù)組2）和3mmol/L（鎂干預(yù)組3），共刺激7d。 3不同濃度鎂離子對VSMCs鈣化的影響 VSMCs鈣化檢測分別用茜素紅（Alizarin red stain）鈣化染色和比色法測定細胞內(nèi)鈣含量的方法。 4不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs堿性磷酸酶（ALP）活性的影響 取3～5代細胞接種于6孔板，細胞密度約為2×105/孔，干預(yù)時間為7d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞2～3次，每孔加入500μL0.1％TritonX-100置4℃環(huán)境中約12～24h，然后反復(fù)吹打裂解細胞后置于離心管中離心，按化學(xué)發(fā)光法檢測ALP活性。 5不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs Cbfα1mRNA表達的影響 運用RT-PCR方法研究不同濃度鎂離子對VSMCs中Cbfα1mRNA水平表達的影響。 6統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS13.0軟件進行分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（x s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間均數(shù)兩兩比較用SNK檢驗（Student-Newman-Keuls），以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1VSMCs原代培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法獲取原代大鼠VSMCs，通常情況下貼壁的動脈組織塊約3～4d后可爬出少許細胞，以長梭形為主，排列較分散，隨著時間延長細胞數(shù)目顯著增多，約6～7d細胞可鋪滿大部分瓶底。當(dāng)細胞數(shù)目占瓶底面積的80～90%時可傳代，傳代后細胞起初為圓形或橢圓形，貼壁后可逐漸伸展為梭形，胞漿豐富，，核呈圓形或卵圓形，多個細胞交錯重疊生長，呈典型的“峰-谷”樣。用免疫細胞化學(xué)法檢測平滑肌細胞特異性的抗體—α-平滑肌肌動蛋白抗體（α-SMA actin），其陽性結(jié)果為細胞胞漿強表達，呈棕黃色的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。 2不同濃度鎂離子對VSMCs鈣化的影響 運用茜素紅鈣化染色對VSMCs染色結(jié)果示：各實驗組與陰性對照組相比，VSMCs鈣化染色均不同程度地加重，而鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大鈣化結(jié)節(jié)染色程度逐漸降低，當(dāng)鎂離子濃度為2mmol/L開始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)縮小，呈濃度依賴性，3mmol/L時鈣化結(jié)節(jié)顯著降低，達最小狀態(tài)。 運用比色法測定VSMCs內(nèi)鈣含量結(jié)果示：與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組刺激VSMCs后，鈣含量均顯著增加，鎂干預(yù)組與高磷組相比，鈣含量隨著鎂離子的變化而變化，其結(jié)果呈負相關(guān)，即鎂離子濃度越大，鈣含量越低，并當(dāng)鎂離子濃度為2mmol/L開始鈣含量明顯降低，當(dāng)鎂離子濃度達3mmol/L時，鈣含量檢測結(jié)果也相應(yīng)達最小值，且各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 3不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs ALP活性的影響 鎂離子刺激VSMCs后不同組間ALP結(jié)果示：與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組VSMCsALP水平均不同程度地增加。鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大，ALP活性的變化趨勢與鈣含量結(jié)果相似，亦呈濃度依賴性，3mmol/L時ALP活性達最小值。 4不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs Cbfα1mRNA表達的影響 不同濃度鎂離子刺激VSMCs后不同組間Cbfα1mRNA的表達結(jié)果示：與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組的VSMCs Cbfα1mRNA水平均不同程度地增加，而鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大，Cbfα1mRNA水平也相應(yīng)發(fā)生變化，變化趨勢與鎂離子濃度相關(guān)，呈濃度依賴性，當(dāng)鎂離子濃度為3mmol/L時mRNA水平降至最低，不同組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1鎂離子可抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，且呈濃度依賴性。 2鎂離子抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生鈣化的機制可能是通過抑制VSMCs轉(zhuǎn)分化作用來實現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective:
High phosphorus is an independent risk factor for the calcification of the vascular membrane in chronic kidney disease (CKD) patients, which can cause serious complications such as cardiovascular events. The mechanism for inducing calcification may be by entering cells through the type III sodium and phosphorus transporter (Pit-1) on the membrane of vascular smooth muscle cells (VSMC), causing the transformation of the VSMCs phenotype. Further studies have shown that magnesium ions can inhibit the activity of Pit-1 channels and reduce phosphorus transfer to cells, and can antagonize the phosphorus in cells in a competitive manner, and play a role in the regulation of phosphorus levels in cells. However, the relationship between magnesium ion and vascular smooth muscle cell calcification is not clear. This study aims to induce high phosphorus induction. The VSMCs calcification model was used to investigate the relationship between magnesium ions and VSMCs calcification, so as to clarify the role of magnesium ions in VSMCs calcification.
Method錛

本文編號：1959105