發(fā)布時(shí)間：2018-05-29 14:06

  本文選題：脂肪 + 腎衰竭��； 參考：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景：腎臟疾病惡化進(jìn)展多發(fā)展為終末期腎臟病(ESRD),即慢性腎功能衰竭的終末階段-尿毒癥期,治療手段只能依靠血液透析、腹膜透析與腎移植,治療成本高,生活質(zhì)量下降,并且腎源短缺,成為腎移植治療的瓶頸,服用較多抗排斥藥物,導(dǎo)致免疫力降低,容易并發(fā)感染。而且晚期腎功能衰竭患者,常常合并有多種并發(fā)癥,其中心血管系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率高,是導(dǎo)致該類病人死亡的首位致死性并發(fā)癥,一旦發(fā)生其防控治療難度均大大增加,治療成本大大增加,多數(shù)均以死亡告終,嚴(yán)重威脅腎功能衰竭患者的生命,降低其生存質(zhì)量。目前大量研究主要針對(duì)慢性腎功能衰竭晚期心血管并發(fā)癥防治,其中研究該類患者主動(dòng)脈脂肪沉積及血液中脂肪譜濃度變化的較多,但成效較低,成本較高。故,重點(diǎn)應(yīng)該放在早期腎衰竭患者心血管并發(fā)癥的防治方面,這樣效果比晚期好,成本低,而恰恰此類研究極少,并且思路欠清晰,綜合研究少,僅僅探討其初步的機(jī)制,這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。有少數(shù)研究報(bào)道了核心蛋白聚糖基因治療大鼠慢性腎衰竭有一定的療效,但亦未深入研究其具體的機(jī)制,以及除了腎衰竭腎臟本身的損傷外,還是否對(duì)心血管并發(fā)癥有一定的影響,均未進(jìn)一步深入研究。故,本研究設(shè)想,擬將早期腎衰竭大鼠的脂肪沉積及血液中脂肪譜濃度變化,心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展,以及核心蛋白聚糖基因治療腎衰竭,延緩腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化,減緩腎衰竭的發(fā)展,從而影響其脂肪沉積、血液中脂肪譜濃度變化,減緩改善心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展,從而尋找出早期防止腎衰竭及心血管并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展、惡化的新的有效治療手段。研究目的：本研究主要探討早期腎衰竭大鼠主動(dòng)脈脂肪沉積及血液中脂肪譜濃度變化,及其引發(fā)心血管并發(fā)癥的機(jī)制；分子水平闡明核心蛋白聚糖基因治療慢性腎衰竭的療效,以及是否能夠防治并發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂、心血管并發(fā)癥,探討可能的機(jī)制。方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備與分組共186只成年SD大鼠,96只雄性,90只雌性,均購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心,體重約150g-200g。在無菌條件下應(yīng)用兩步法,行5/6腎切除手術(shù)制造腎衰竭大鼠模型。假手術(shù)組僅僅切開腹腔,再立即縫合,保留腎臟。兩部分實(shí)驗(yàn)入組大鼠共168只,其余18只根據(jù)需要,同等條件制造相應(yīng)模型,作為意外死亡大鼠的補(bǔ)充。2.相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)2.1第一部分實(shí)驗(yàn)2.1.1實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組,接受真正的兩步法行5/6腎切除手術(shù)制造腎衰竭大鼠模型,n=24；對(duì)照組,僅僅接受手術(shù)切開腹腔皮膚,但保留腎臟,即假手術(shù)組,n=24。分別在第0天、第10天、第30天、第60天處死6只大鼠,用于取主動(dòng)脈弓檢測(cè)脂肪沉積情況。第40天時(shí)不處死,僅抽血。2.1.2血漿、紅細(xì)胞膜及主動(dòng)脈弓脂肪的動(dòng)態(tài)變化采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第40天和第60天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞膜磷脂的動(dòng)態(tài)變化。采集檢測(cè)第0天、第10天、第30天、第60天血漿甘油三酯、總膽固醇、磷脂的動(dòng)態(tài)濃度變化,以及主動(dòng)脈弓脂肪的動(dòng)態(tài)變化。其中血漿甘油三酯的檢測(cè)采用甘油-3-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法(PAP法),總膽固醇采用鉬酸銨還原法,紅細(xì)胞膜脂肪、主動(dòng)脈脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪,其后甘油三酯仍采用PAP法,總膽固醇采用鉬酸銨還原法,磷脂則采用酸消化后,采用鉬藍(lán)比色法先檢測(cè)出無機(jī)磷濃度,在采用無機(jī)磷與磷脂的換算系數(shù)計(jì)算得出。其他生化指標(biāo)如血肌酐則采用PAP比率法。2.2第二部分實(shí)驗(yàn)2.2.1實(shí)驗(yàn)分組A組,30只大鼠,行假手術(shù),保留腎臟；其余均接受真手術(shù)制造腎衰竭大鼠模型。所有大鼠在手術(shù)后均可自由進(jìn)飲食；等到真手術(shù)組大鼠腎衰竭模型建立成功,則進(jìn)一步隨機(jī)分組,1)B組,手術(shù)對(duì)照組,不接受任何治療,n=30；2)C組,空白治療對(duì)照組,僅僅接受空白載體轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞[FB(LXSN)cells]治療,n=30；3)D組,治療組,接受核心蛋白聚糖載體轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞[FB(LDCNSN)cells]治療,n=30。分別在第0天、第10天、第20天、第30天、第60天每組處死6只大鼠,用于取腎臟組織、主動(dòng)脈弓。第40天時(shí)只抽血,不處死。2.2.2顯微鏡觀察腎臟病理變化觀察第0天、第30天、第60天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的變化。采用HE、PAS、Masson染色等應(yīng)用普通光鏡觀察腎臟病理變化,采用半定量分級(jí)法：0,正常；Ⅰ,腎臟病變(腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化)≤30%；Ⅱ,腎臟病變(腎小球硬化、腎問質(zhì)纖維化)31-60%；Ⅲ,腎臟病變(腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化)≥61%。2.2.3成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及注射FB (LDCNSN)和FB (LXSN)細(xì)胞均在改良的良伊格爾DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含300ng/ml的G418與10%的胎牛血清)中孵育培養(yǎng)。DCN轉(zhuǎn)染的載體導(dǎo)入FB細(xì)胞,培養(yǎng)成FB (LDCNSN)細(xì)胞,空白載體導(dǎo)入FB細(xì)胞,培養(yǎng)成FB (LXSN)細(xì)胞,后應(yīng)用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶消化收集,然后應(yīng)用高壓無菌生理鹽水沖洗3次。將細(xì)胞濃度調(diào)整到1X106/ml,采用多點(diǎn)注射法注射到腎髓質(zhì),使之達(dá)到約1X106/腎的注射量。2.2.4甘油三酯、總膽固醇、總磷脂、血肌酐、尿素氮的測(cè)定均采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞膜總膽固醇、總磷脂的動(dòng)態(tài)變化。均采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第30天、第60天血脂及主動(dòng)脈弓脂肪的動(dòng)態(tài)變化。均采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血肌酐、尿素氮的動(dòng)態(tài)變化。其中血漿甘油三酯的檢測(cè)采用甘油-3-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法(PAP法),總膽固醇采用鉬酸銨還原法,紅細(xì)胞膜脂肪、主動(dòng)脈脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪,其后甘油三酯仍采用PAP法,總膽固醇采用鉬酸銨還原法,磷脂則采用酸消化后,采用鉬藍(lán)比色法先檢測(cè)出無機(jī)磷濃度,在采用無機(jī)磷與磷脂的換算系數(shù)計(jì)算得出。其他生化指標(biāo)如血肌酐則采用PAP比率法。2.2.5腎組織中核心蛋白聚糖(DCN)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (TGF-β1)的檢測(cè)檢測(cè)第0天、第30天、第60天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)二者在腎組織中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。EnVisionTm免疫組化系統(tǒng)用于檢測(cè)腎組織中的DCN與TGF-β 1的表達(dá)。具體過程：脫蠟、微波修復(fù)抗原10min、每個(gè)玻片加1滴3%雙氧水、室溫孵育20mmin、加一抗(兔抗鼠單克隆抗TGF-β1抗體、兔抗鼠單克隆抗DCN)、1：200稀釋、室溫孵育2h,磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗5minX3次、加抗生物素蛋白、室溫孵育20min、PBS漂洗3min、加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,、室溫孵育30min、PBS漂洗5minX3次、加3,3'-二氨基聯(lián)苯胺、光鏡觀察5min、加用蘇木精復(fù)染和01.%鹽酸保存、流動(dòng)水水沖洗、顯藍(lán)色、乙醇梯度脫水、加二甲苯、樹膠封片、空氣風(fēng)干。觀察DCN與TGF-β1的表達(dá),采用半定量觀察其分布法：0,沒有染色；1,偶然有染色；2,局灶性染色；3,彌漫性染色。3.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量數(shù)值以x±s表示,根據(jù)需要選用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)或單因素方差分析及線性相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組BUN和Scr濃度在第10天達(dá)到最高(分別為26.56±2.16 mmol/1和308.50±15.73 mol/1)。濃度在第20天開始下降,第40天值最低(分別為16.22±3.57 mmol/l和193.45±20.32μmol/1)；不過,這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度都比對(duì)照組的要高(分別為7.89±2.58 mmol/l和91.22±19.73μmol/1)(P0.01).BUN和Scr濃度在第60天再次升高。實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈弓三種脂肪成分甘油三酯、總膽固醇、磷脂均在第10天時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),甘油三酯在第30天、60天時(shí)明顯高于對(duì)照組(P0.05,P0.01)�？偰懝檀�、總磷脂在第10天時(shí)開始升高,在第60天時(shí)明顯高于對(duì)照組(P0.01,P0.05)。血漿TG和T-Ch水平與主動(dòng)脈組織中相應(yīng)脂質(zhì)水平顯著正相關(guān)(r=0.944和r=0.937),而血漿T-PL水平剛與主動(dòng)脈組織中T-PL水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.832)。實(shí)驗(yàn)組血漿中甘油三酯、總膽固醇均在第10天開始升高,并持續(xù)升高,在第10天、第30天、第40天、第60天時(shí)均高于對(duì)照組(P0.05)�？偭字诘�10天時(shí)明顯升高,然后在第20天、30天時(shí)降低,在第60天時(shí)復(fù)又開始輕度升高。實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞膜總膽固醇在第10天開始升高,在第40天、60天時(shí)明顯高于對(duì)照組(P0.05),紅細(xì)胞膜總磷脂在第20天時(shí)較對(duì)照組輕度降低(P0.05),在第40天、60天時(shí)則較對(duì)照組明顯降低(P0.01)。紅細(xì)胞膜中T-Ch的水平與血漿T-Ch水平顯著正相關(guān)(r=0.946)。2.第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用核心蛋白聚糖治療干預(yù)后,D組在第10天之后的各時(shí)間點(diǎn)血尿素氮、血肌酐均較B組與C組上升幅度明顯變小(P0.05),但仍較A組上升(P0.05)。D組在第30天和第60天DCN在腎組織中表達(dá)較B組、C組均明顯增加(P0.01)。D組中TGF-β1表達(dá)在第30天和第60天則較B、C組均有所減少(P0.05),但仍較A組仍明顯增加(P0.05),B組、C組與本組第0天及A組比較亦明顯增加(P0.01)采用核心蛋白聚糖治療干預(yù)后,D組在第30天、60天血脂成分升高幅度均低于B組與C組(P0.01),亦較A組升高,差異程度小于與B組及C組的差異(P0.05),主動(dòng)脈弓血脂變化與血脂類似,D組紅細(xì)胞膜總膽固醇在第20天開始升高,在第30天、60天明顯升高,但升高幅度均小于B組與C組(P0.05),磷脂則在第20天開始降低,第30天、60天時(shí)明顯降低,降低幅度亦明顯小于B組與C組(P0.05)。結(jié)論：早期慢性腎衰竭大鼠血脂升高,主動(dòng)脈脂肪沉積增加,發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)增加。紅細(xì)胞膜膽固醇增加,磷脂降低,膜的僵硬程度增加,變形能力變差。應(yīng)用核心蛋白聚糖基因治療后,不但能延緩腎衰竭的惡化進(jìn)展,改善其腎功能,而且能夠減輕其血脂紊亂,從而可能延緩動(dòng)脈粥樣硬化性心血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展,改善預(yù)后。
[Abstract]:This study has focused on the prevention and treatment of cardiovascular complications in patients with advanced renal failure . Objective : To study the effect of early renal failure ( ARF ) on the changes of fat concentration in aorta and the mechanism of cardiovascular complications in rats with early renal failure .
Methods : 1 . The experimental animals were prepared and grouped into 186 adult SD rats , 96 males and 90 females were purchased from Laboratory Animal Center of Shandong University .
The dynamic changes of plasma triglyceride , total cholesterol , and phospholipid in plasma , erythrocyte membrane and aortic arch were measured by using the method of PAP method .
All the rats were free to enter the diet after surgery .
When the renal failure model was established successfully in the operation group , the patients were randomly divided into 1 ) group B , the control group received no treatment , n = 30 ;
2 ) Group C , blank treatment control group , only accept blank vector transfected fibroblast growth FB ( LXSN ) cells treated , n = 30 ;
2 . 2 . 2 . The pathological changes of kidney were observed on day 0 , 30th day and 60th day respectively .
I , renal disease ( glomerulosclerosis , renal interstitial fibrosis ) 鈮，

本文編號(hào)：1951148