本文選題：miR-184 + miR-150��； 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文

【摘要】：腎臟是機(jī)體衰老比較快的器官之一，衰老過程中伴隨著腎功能的逐步下降，老年腎臟病理中會出現(xiàn)腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多、腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化等，但目前對腎臟衰老機(jī)制的研究還不明確，因此，了解腎臟衰老的機(jī)制對相關(guān)腎臟疾病的治療將具有重要的意義。 微小RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中廣泛存在的非編碼單鏈小分子RNA，具有高度保守的序列和功能，互補(bǔ)結(jié)合靶基因而降解mRNA或抑制mRNA翻譯，負(fù)調(diào)控表達(dá)靶基因。在機(jī)體發(fā)育、免疫、衰老、腫瘤及癌癥等多種生理病理過程中，miRNA中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞通過溶酶體對自身受損結(jié)構(gòu)的吞噬降解過程稱為自噬，研究表明衰老與自噬關(guān)系密切。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，旨在闡明在腎臟組織衰老進(jìn)程，miRNA差異表達(dá)的確切作用及對自噬的影響，及其在調(diào)控系膜細(xì)胞衰老作用中的分子機(jī)制。全文共分三個部分： 第一部分：熱量限制影響老年大鼠腎臟組織中miRNA的表達(dá)變化及其驗(yàn)證 通過飲食限制對大鼠衰老進(jìn)程進(jìn)行干預(yù)，過碘酸-希夫氏堿（PAS）染色，觀察大鼠的腎臟病理變化，miRNA芯片檢測正常飲食（AL）或熱量限制（CR）對大鼠腎臟皮質(zhì)miRNA表達(dá)的影響，最后RT-PCR鑒定差異表達(dá)的miRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與3月齡大鼠相比，24月齡AL和CR組大鼠腎臟組織均顯示出衰老特征，而24月齡CR組與AL組相比，腎小球系膜細(xì)胞增生較輕，小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和小管萎縮硬化減輕。芯片掃描及聚類分析結(jié)果顯示CR組與AL組24月齡大鼠腎組織中miRNA-132、miRNA-150和miRNA-184的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05），且三種miRNAs均被下調(diào)。RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果，與正常飲食組相比，能量限制組miRNA-132、miRNA-150和miRNA-184分別下調(diào)了66.9%，66%和96.7%（p 0.05）。同時，驗(yàn)證了老年大鼠腎臟皮質(zhì)miRNA-132、miRNA-150和miRNA-184的表達(dá)明顯高于青年大鼠（p 0.05）。本部分研究結(jié)果顯示，熱量限制可抑制大鼠腎臟組織的衰老，miRNA-132、miRNA-150和miRNA-184的差異表達(dá)可能參與了腎組織衰老過程的調(diào)控。 第二部分：miR-184和miR-150通過調(diào)控系膜細(xì)胞自噬活性影響氧化損傷和衰老 首先通過分離AL組24月齡大鼠腎臟固有細(xì)胞（腎小球系膜細(xì)胞，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞），RT-PCR分析miR-184和miR-150在3種細(xì)胞中的表達(dá)以確定兩種miRNA起主要調(diào)控作用的細(xì)胞并建立體外研究模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-184和miR-150在系膜細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于其它兩種細(xì)胞中的表達(dá)（p0.05～0.01），故選擇系膜細(xì)胞作為體外研究的細(xì)胞模型。以從3月齡和24月齡大鼠腎組織分離得到的原代系膜細(xì)胞作為模型，通過干預(yù)miR-184和miR-150的表達(dá)，觀察其對系膜細(xì)胞胞內(nèi)自噬水平以及氧化應(yīng)激損傷和衰老進(jìn)程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：24月齡大鼠來源的系膜細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老特征，SA-β-gal和衰老相關(guān)異染色質(zhì)（SAHF）陽性率達(dá)到95%以上，與3月齡大鼠來源的細(xì)胞差異顯著（p0.01）；同時與年輕組細(xì)胞相比，衰老細(xì)胞中氧化損傷產(chǎn)物（MDA，8-OhdG以及羰基化蛋白質(zhì)）含量顯著增加（p0.01），miR-184和miR-150表達(dá)升高，自噬作用標(biāo)記分子LC3表達(dá)減少，且泛素蛋白酶降解系統(tǒng)相關(guān)蛋白p62表達(dá)增加，細(xì)胞自噬活性降低，提示，衰老組系膜細(xì)胞中miR-184和miR-150表達(dá)的增加可能通過抑制自噬活性而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。轉(zhuǎn)染外源miR-184和miR-150mimics促使二者高表達(dá)后，LC3表達(dá)降低，p62表達(dá)升高，自噬降低；而在轉(zhuǎn)染miR-184和miR-150inhibitors后，，細(xì)胞凈自噬水平升高。同時，長效轉(zhuǎn)染miR-184和miR-150mimics后，SA-β-gal和SAHF細(xì)胞陽性率升高（p0.05），氧化損傷產(chǎn)物積累增加。本部分結(jié)果表明，miR-184和miR-150可能通過抑制系膜細(xì)胞的自噬從而調(diào)控系膜細(xì)胞衰老。 第三部分：miR-184和miR-150通過靶向Rab1和Rab31調(diào)控細(xì)胞自噬活性 利用生物信息學(xué)軟件，比如Targetseans、miRanda和PicTar，預(yù)測miR-184和miR-150潛在的靶基因；通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-184和miR-150對靶基因表達(dá)的影響；進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測miR-184和miR-150與靶基因3′-UTR序列的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-184可能的靶基因有239-649個，而miR-150有209-2825個，其中與自噬體形成和成熟相關(guān)的Rab蛋白家族有很多成員為miR-184和miR-150共同的靶基因，本研究擬選擇Rab1和Rab31靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-184和miR150mimics或inhibitors對系膜細(xì)胞Rab1和Rab31mRNA水平無顯著影響（p0.05），但miR-184和miR150mimics可以顯著下調(diào)二者蛋白的表達(dá)水平（p0.05～0.01），而miR-184和miR150inhibitors分別轉(zhuǎn)染后Rab1表達(dá)上調(diào)了78%和56%（p0.05），Rab31上調(diào)86%和67%(p0.05)。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示：miR184和miR-150能通過與Rab1和Rab31mRNA的3′-UTR相互作用而下調(diào)熒光素酶活性（p0.05～0.01）。本部分研究證實(shí)， miR184和miR-150可以直接作用于Rab家族蛋白信使mRNA3′-UTR而降解或抑制其表達(dá)，從而阻止其參與細(xì)胞自噬過程的調(diào)節(jié)。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)熱量限制老年大鼠與正常飲食老年大鼠腎臟皮質(zhì)miRNAs的表達(dá)存在差異，其中包括miR-184和miR-150，腎小球系膜細(xì)胞是miR-184和miR-150差異表達(dá)發(fā)生的主要腎組織固有細(xì)胞。體外研究證實(shí)，miR-184和miR-150能作用于共同的靶基因Rab1和Rab31mRNA從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性，并進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)氧化損傷產(chǎn)物的積累而最終調(diào)控細(xì)胞的衰老進(jìn)程。
[Abstract]:The kidney is one of the organs of fast aging, with the gradual decline of renal function in the aging process. There will be glomerular hypertrophy, mesangial matrix increase, glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis in the aged kidney pathology. However, the study of renal aging mechanism is not clear. Therefore, the mechanism of renal aging is related to the related mechanisms. The treatment of kidney disease will be of great significance.
Small RNA (microRNA, miRNA) is a non coding single strand small molecule RNA widely existed in eukaryotes, with highly conservative sequences and functions, complementing the target gene to degrade mRNA or inhibit mRNA translation and negatively regulate the expression of target genes. In the physiological and pathological processes, such as body development, immunity, senescence, swelling and cancer, miRNA plays an important role in miRNA The phagocytosis and degradation process of cells through lysosomes on their damaged structures is called autophagy. The study shows that senescence is closely related to autophagy. The purpose of this study is to elucidate the exact role of miRNA differential expression and the effect on autophagy in the renal tissue aging process and the molecules in regulating the senescence of mesangial cells through the experiments in vitro and in vivo. The full text is divided into three parts:
Part one: the effect of caloric restriction on the expression of miRNA in kidney tissues of aged rats and its validation
The effects of dietary restriction on the aging process of rats, periodate Schiff's alkali (PAS) staining, and the pathological changes of kidney in rats were observed. The effect of normal diet (AL) or caloric restriction (CR) on the expression of miRNA in renal cortex of rats was detected by miRNA chip. The final RT-PCR identification of differential expression of miRNAs. found that compared with 3 month old rats, 24 months The renal tissue of rats aged AL and CR showed aging characteristics, and the glomerular mesangial cell proliferation was lighter, tubulointerstitial inflammatory cell infiltration and tubuloatrophy sclerosis reduced in the 24 month old CR group compared with the AL group. The results of chip scanning and cluster analysis showed the differences in miRNA-132, miRNA-150 and miRNA-184 in the kidney tissues of the 24 month old rats of the CR group and the AL group. The expression was statistically significant (P0.05), and three kinds of miRNAs were downregulated by.RT-PCR to further verify the results. Compared with the normal diet group, the energy restriction group miRNA-132, miRNA-150 and miRNA-184 were down 66.9%, 66% and 96.7% respectively (P 0.05). Meanwhile, the expression of renal cortex miRNA-132, miRNA-150 and miRNA-184 in the aged rats was proved to be obvious. It was higher than that of young rats (P 0.05). The results of this study showed that heat restriction could inhibit the aging of renal tissue in rats, and the differential expression of miRNA-132, miRNA-150 and miRNA-184 may be involved in the regulation of renal tissue aging process.
The second part: miR-184 and miR-150 affect oxidative damage and aging through regulating autophagy activity of mesangial cells.
First, by separating the kidney innate cells (glomerular mesangial cells, glomerular endothelial cells and renal tubular epithelial cells) of 24 month old rats, the expression of miR-184 and miR-150 in 3 cells was analyzed to determine the main regulatory role of two miRNA cells and to establish an in vitro study model. The results showed that miR-184 and miR-150 were in the mesangial membrane. The expression in the cells was significantly higher than that of the other two cells (P0.05 ~ 0.01), so the mesangial cells were selected as the cell model in vitro. The primary mesangial cells isolated from the renal tissue of 3 month old and 24 month old rats were used as the model. The intracellular autophagy level of the mesangial cells was observed by interfering with the expression of miR-184 and miR-150. The effects of oxidative stress injury and aging process. The results showed that the mesangial cells of the 24 month old rats had obvious aging characteristics, the positive rate of SA- beta -gal and aging related heterochromatin (SAHF) was more than 95%, and the difference was significant (P0.01) with the 3 month old rat cells, and the oxidative damage in senescent cells compared with the young group cells. The content of MDA, 8-OhdG and carbonylation protein increased significantly (P0.01), the expression of miR-184 and miR-150 increased, the expression of autophagy marker LC3 decreased, and the expression of ubiquitin protease related protein p62 increased and the autophagic activity decreased. The increase of miR-184 and miR-150 in the mesangial cells of the senescent group may pass through the increase of the expression of miR-184 and miR-150. Inhibition of autophagic activity induced cell senescence. After transfection of exogenous miR-184 and miR-150mimics, the expression of LC3 decreased, the expression of p62 increased, and autophagy decreased, and the net autophagy increased after transfection of miR-184 and miR-150inhibitors. Meanwhile, the positive rate of SA- beta -gal and SAHF cells increased after the transfection of miR-184 and miR-150mimics. The results show that miR-184 and miR-150 may regulate the senescence of mesangial cells by inhibiting autophagy of mesangial cells in high (P0.05).
The third part: miR-184 and miR-150 regulate the autophagy activity through targeting Rab1 and Rab31.
Use bioinformatics software, such as Targetseans, miRanda and PicTar, to predict the potential target genes of miR-184 and miR-150; verify the effect of miR-184 and miR-150 on target gene expression through in vitro experiments, and further use the double luciferase reporter gene system to detect the interaction between miR-184 and miR-150 and the target gene 3 '-UTR sequence. It is found that there are 239-649 possible target genes for miR-184, and 209-2825 of miR-150, of which the Rab protein family associated with the formation and maturation of autophago is a common target gene for miR-184 and miR-150. This study is to select the Rab1 and Rab31 target genes for verification. The results were found to be transfected with miR-184 and miR150mimics or inhibitors to the mesangial membrane. The levels of Rab1 and Rab31mRNA were not significantly affected (P0.05), but miR-184 and miR150mimics could significantly decrease the expression level of two proteins (P0.05 ~ 0.01), while Rab1 expression was up to 78% and 56% (P0.05) after miR-184 and miR150inhibitors, and Rab31 up 86% and 67% (P0.05). Luciferase activity (P0.05 ~ 0.01) was down regulated by the interaction with 3 '-UTR of Rab1 and Rab31mRNA. This part of this study confirmed that miR184 and miR-150 could directly act on the Rab family protein messenger mRNA3' -UTR and degrade or inhibit its expression, thus preventing its involvement in the regulation of autophagic pathway.
To sum up, the study found that there was a difference in the expression of miRNAs in the renal cortex of the aged rats and the normal diet old rats, including miR-184 and miR-150, and the glomerular mesangial cells were the main renal tissue innate cells of the differential expression of miR-184 and miR-150. In vitro studies have proved that miR-184 and miR-150 can be used to target the common target. Gene Rab1 and Rab31mRNA regulate autophagic activity at post transcriptional level, and further affect the accumulation of intracellular oxidative damage products and ultimately regulate cell aging process.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

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本文編號：1942613