本文選題：PPP5C + 前列腺癌��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：一、研究背景男性前列腺腫瘤(PCa)是男性所特有的惡性疾病,其發(fā)病相對其他疾病比較隱匿。在早期情況下,患者往往無明顯不適癥狀。根據(jù)ACS在2016年發(fā)布最新的數(shù)據(jù)顯示,前列腺腫瘤在其全國范圍內(nèi)分別位居新發(fā)病例的首位和致死病例的第二位。在中國,近些年前列腺癌的發(fā)病率也逐漸在升高,根據(jù)國家腫瘤中心2015年的數(shù)據(jù)提示前列腺癌目前在男性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率已經(jīng)接近膀胱癌。針對早期局限性前列腺癌的治療,目前主要的治療手段是以手術(shù)為主的根治性治療,其5年生存率可達(dá)到百分之九十九以上,預(yù)后極佳。而對于中晚期的前列腺癌,5年生存率在28%-32%之間,療效欠佳。內(nèi)分泌治療是前列腺惡性腫瘤最重要的治療方式,針對預(yù)期壽命10年,術(shù)后生化復(fù)發(fā),或者晚期轉(zhuǎn)移性患者,其具有療效佳、創(chuàng)傷低、并發(fā)癥少等優(yōu)勢。但是,內(nèi)分泌治療的患者平均在一年半到兩年的時間內(nèi)容易轉(zhuǎn)變?yōu)镃RPC的患者,導(dǎo)致腫瘤迅速進(jìn)展。因此,深入探索前列腺癌進(jìn)展的靶點,并進(jìn)一步探討可能的潛在的機制,從而為前列腺癌的早期診斷、進(jìn)展檢測以及綜合治療提供依據(jù)是目前泌尿腫瘤外科領(lǐng)域的熱點。PPP5C是絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶家族主要成員之一,在細(xì)胞生命活動比如應(yīng)激等當(dāng)中構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前發(fā)現(xiàn)PPP5C參與調(diào)節(jié)的生理活動包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷修復(fù)以及激素代謝等,可涉及到MAPK、ATM、ATR、P53、GR以及ASK1等重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及信號分子。近些年來,有文獻(xiàn)報道PPP5C基因的異常與多種腫瘤相關(guān)。敲除PPP5C的表達(dá)后,能夠抑制膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長,并且能夠抑制多種惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。同時文獻(xiàn)報道在過表達(dá)PPP5C后的乳腺癌小鼠模型中,腫瘤細(xì)胞的增殖明顯增快。因此,PPP5C與多種惡性腫瘤的相關(guān)性已經(jīng)得到證實,但是其相關(guān)機制仍尚未闡明。本課題基于對前列腺癌患者手術(shù)組織標(biāo)本以及Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫中前列腺癌標(biāo)本以及癌旁標(biāo)本的PPP5C表達(dá)水平的檢測,并利用慢病毒介導(dǎo)的途徑構(gòu)建PPP5C敲減細(xì)胞系模型來進(jìn)一步研究PPP5C對于前列腺癌的調(diào)控及下游潛在的調(diào)節(jié)機制。二、研究目的在前列腺癌患者手術(shù)標(biāo)本以及公開的芯片數(shù)據(jù)庫中分析PPP5C的表達(dá)水平,并進(jìn)一步探討PPP5C對前列腺癌細(xì)胞腫瘤學(xué)特性及下游關(guān)鍵的調(diào)控機制。三、研究方法(一)ppp5c在前列腺癌手術(shù)組織標(biāo)本的蛋白表達(dá)水平檢測及利用oncomine芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)性分析2014.9月-2015.9月于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院收集前列腺癌患者行腹腔鏡下前列腺癌根治術(shù)的手術(shù)標(biāo)本,在液氮中保存。每例患者配對收集癌組織與癌旁組織,共獲得52例前列腺癌與前列腺癌旁組織標(biāo)本,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化流程制備成冰凍石蠟切片,運用ich檢測ppp5c在癌及癌旁組織的蛋白水平,同時收集52例手術(shù)患者的一般臨床資料和手術(shù)病理結(jié)果的信息,進(jìn)行分析。應(yīng)用oncomine芯片數(shù)據(jù)庫,獲取公開的芯片相關(guān)數(shù)據(jù)資料,摘錄ppp5c在前列腺癌與癌旁組織的mrna值,開展比較分析。(二)前列腺癌細(xì)胞系中ppp5c的基礎(chǔ)表達(dá)水平檢測并通過慢病毒介導(dǎo)構(gòu)建前列腺癌ppp5c敲減細(xì)胞株模型應(yīng)用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)(real-timequantitativepcrdetectingsystem,qpcr)檢測不同前列腺癌細(xì)胞株(lncap,22rv1,pc3,du145)ppp5c基因的mrna表達(dá)水平以及蛋白免疫印跡(westernblotting,wb)的方法檢測前列腺癌細(xì)胞株中ppp5c的蛋白水平。選取ppp5c水平較高的pca細(xì)胞株作為構(gòu)建沉默ppp5c的候選細(xì)胞株。根據(jù)ppp5c基因序列,設(shè)計能夠靶向ppp5c的shrna并插入到含有綠色熒光檢測系統(tǒng)的質(zhì)粒,進(jìn)一步構(gòu)建能夠穩(wěn)定靶向沉默ppp5c并且含有綠色熒光基因的慢病毒載體lv-shppp5c。將lv-shppp5c感染候選細(xì)胞株,利用綠色熒光評估感染效率,利用real-timeqpcr以及westernblotting分別評估受感染細(xì)胞株的mrna情況以及蛋白情況以評估敲減效率。(三)檢測ppp5c基因低表達(dá)后的前列腺癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞遷移能力變化以及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡水平變化在ppp5c沉默組(lv-shppp5c)、空質(zhì)粒組(lv-shcon)、空白對照組(con)三組中開展腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能實驗,mtt、克隆形成評估各個細(xì)胞的增殖特性,劃痕實驗的愈合能力結(jié)果評估惡性腫瘤細(xì)胞的遷移特性,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合pi染色法檢測細(xì)胞分裂各個時相分布變化,采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合annexinv/pi雙染色法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況。(四)ppp5c對前列腺癌惡性生物學(xué)調(diào)控的下游機制的初步探索在前期穩(wěn)定沉默ppp5c基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行蛋白水平下游機制分析。培養(yǎng)細(xì)胞、樣本收集、蛋白裂解以及開展蛋白免疫印跡評估下游蛋白水平以及蛋白磷酸化水平的變化。四、研究結(jié)果(一)ppp5c的蛋白分子水平在前列腺癌組織中較癌旁組織中相對上調(diào)通過臨床手術(shù)標(biāo)本收集共得到52對前列腺癌組織及癌旁組織,通過免疫組織化學(xué)染色分析,發(fā)現(xiàn)ppp5c的蛋白水平在pca當(dāng)中升高,存在統(tǒng)計學(xué)差異。pca組織切片中的ppp5c免疫組化結(jié)果提示其在癌中深度較癌旁組織深,陽性細(xì)胞數(shù)較癌旁多。(二)oncomine芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步在mrna水平驗證ppp5c在前列腺癌中高表達(dá)并在轉(zhuǎn)移性組織中升高利用oncomine芯片數(shù)據(jù)庫分析前列腺癌mrna相關(guān)分子水平,摘錄前列腺癌組織及前列腺癌旁組織中的ppp5c表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計分析。發(fā)現(xiàn)在4個數(shù)據(jù)庫中ppp5c的表達(dá)在pca中顯著升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異。進(jìn)一步比較pca轉(zhuǎn)移灶組織與原位pca中ppp5c的mrna表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性pca組織在4個數(shù)據(jù)庫中明顯比原位pca組織上調(diào),具有統(tǒng)計學(xué)差異。(三)利用shrna介導(dǎo)的途徑構(gòu)建ppp5c低表達(dá)水平的pca細(xì)胞株模型real-timeqpcr以及westernblotting檢pca各細(xì)胞系ppp5c水平,發(fā)現(xiàn)在pca常見細(xì)胞株均有ppp5c的表達(dá)。并且在du145、pc3、22rv1中ppp5c的表達(dá)較lncap高。慢病毒lv-shppp5c感染du145、pc3、22rv1細(xì)胞系,real-timeqpcr以及westernblotting實驗顯示ppp5c在實驗組中成功低表達(dá),穩(wěn)定低表達(dá)ppp5c的pca細(xì)胞株模型構(gòu)建成功。(四)穩(wěn)定沉默PPP5C水平后DU145、PC3、22RV1的增殖及克隆形成明顯受到抑制MTT實驗顯示在三個前列腺癌細(xì)胞株中穩(wěn)定沉默PPP5C組較對照組細(xì)胞增殖能力減弱,增殖曲線抑制,具有顯著差異。并且lv-shPPP5C組細(xì)胞克隆數(shù)量明顯減少,其形狀顯著變小。(五)PPP5C敲減誘導(dǎo)DU145、PC3、22RV1細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期利用PI染色,流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)顯示DU145、PC3、22RV1細(xì)胞系中l(wèi)v-shPPP5C組G0/G1期上調(diào),S期、G2/M期不同程度下降,具有統(tǒng)計學(xué)差異。(六)PPP5C沉默導(dǎo)致DU145、PC3、22RV1凋亡增加Annexin V/PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析,DU145、PC3、22RV1細(xì)胞穩(wěn)定沉默PPP5C組中Annexin V(+)/PI(-)較對照組上升,同樣Annexin V(+)/PI(+)較對照組升高,說明敲減PPP5C誘導(dǎo)PCa細(xì)胞凋亡增加。(七)PPP5C低表達(dá)抑制DU145、PC3的遷移能力劃痕實驗提示DU145、PC3在低表達(dá)PPP5C后其劃痕的修復(fù)能力明顯減弱,實驗組切口愈合面積較對照組降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異。(八)PPP5C沉默細(xì)胞株中JUK以及ERK磷酸化水平增加在沉默了PPP5C基因組的模型中,WB實驗顯示其JNK、ERK的非磷酸化水平無明顯變化,而磷酸化的JNK、ERK水平明顯上調(diào),并且發(fā)現(xiàn)c-PARP升高、CDK4下調(diào)。五、研究結(jié)論本課題表明PPP5C分子在PCa中發(fā)揮重要的功能,其在癌組織中異常高表達(dá)。沉默PPP5C表達(dá)后,前列腺癌的惡性生物學(xué)功能細(xì)胞增殖、克隆能力、遷移能力都受到抑制,凋亡增加以及周期阻滯。WB水平檢測提示其JNK及ERK分子的磷酸化水平增加,凋亡相關(guān)的蛋白分子c-PARP增加以及周期相關(guān)蛋白CDK4表達(dá)降低,預(yù)示PPP5C是促進(jìn)PCa進(jìn)展的潛在的分子靶標(biāo)。
[Abstract]:In recent years , it has been reported that PPP5C is one of the most important treatments for prostate cancer , and it has the advantages of good curative effect , low trauma and less complications . The expression level of ppp5c in prostate cancer cell line was determined and the expression level of ppp5c in prostate cancer cell line was determined . (鍥，

本文編號：1915974