本文選題：缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷 + 細胞凋亡��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景與研究目的急性腎損傷(AKI)是一組具有高致死率和高花費的臨床常見��；其中,腎臟低灌注為AKI的主要發(fā)病因素。缺血再灌注(I/R)腎損傷常出現(xiàn)于腎臟移植、腎臟相關(guān)手術(shù)、腎臟疾病及創(chuàng)傷后,極易發(fā)展為慢性腎功能不全,并與一系列嚴(yán)重的腎外損傷相關(guān)。盡管有關(guān)腎臟I/R損傷的研究很多,目前針對缺血再灌注造成的急性腎損傷尚無有效治療方式。一系列病理過程參與腎臟I/R損傷的發(fā)生,其中氧化應(yīng)激是再灌注損傷中的始動因素。缺血再灌注損傷時,大量活性氧簇(ROS)生成,引起細胞內(nèi)抗氧化物活性減低,DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞；并且有證據(jù)表明在豬腎臟I/R損傷模型中,8-oxodG (DNA氧化損傷標(biāo)志物)表達上調(diào)。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是再灌注過程中ROS的主要來源,它由與細胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的NOX異構(gòu)體,p22phox亞基和存在于細胞質(zhì)基質(zhì)中的p47phox, p67phox, p40phox和Rac亞基組成。NOX4是腎臟中NADPH氧化酶表達量最豐富的類型,NOX2在腎臟也有表達。NOX4 和 NOX2的表達在豬腎臟I/R損傷中均明顯上調(diào)。因此,恢復(fù)細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)活性及抑制NADPH氧化酶的激活有助于減輕氧化應(yīng)激損傷程度。盡管腎小管上皮細胞壞死一直被認(rèn)為是缺血性AKI的標(biāo)志性改變,但是在人腎組織活檢中,壞死細胞數(shù)量無法準(zhǔn)確預(yù)測腎功能的惡化情況,并且越來越多研究表明,凋亡為缺血性AKI中另一種重要的細胞死亡形式,它能更好的預(yù)測腎功能的進展情況。在腎臟細胞中,I／R損傷激活Bax,促進其線粒體轉(zhuǎn)位,增加線粒體外膜通透性,下調(diào)Bcl2表達,促進細胞凋亡。此外,近年來研究表明,過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)活化被認(rèn)為是I／R損傷的重要治療靶點,其激動劑可減少I／R損傷后組織中細胞凋亡水平,改善損傷組織功能。硝基脂肪酸是活性一氧化氮(.NO)及亞硝酸根離子(NO2)與不飽和脂肪酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)合成的衍生物,包括硝基油酸(OA-NO2)和硝基亞油酸(LNO2)。它們可與蛋白中的親核氨基酸發(fā)生可逆的Micha el加成反應(yīng),介導(dǎo)-系列廣泛的信號調(diào)節(jié)、血管保護、過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)活化、抗炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激作用。有研究表明,在心臟缺血再灌注損傷中,硝基脂肪酸可縮小心肌梗死范圍,提高心肌細胞存活率；在腎臟缺血再灌注損傷中,硝基油酸可改善腎功能,下調(diào)腎組織中炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平。然而其腎臟保護的具體機制尚不明確。根據(jù)上述背景,本研究擬建立腎小管上皮細胞缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)模型來模擬腎臟缺血再灌注損傷,觀察硝基油酸對OGD/R引起的細胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的作用；并進一步探討其抗凋亡、抗氧化的作用機制。研究方法1.為明確硝基油酸對缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)處理后腎小管上皮細胞凋亡的作用及機制,選取人腎小管上皮細胞系(HK-2),給予缺糖缺氧16小時后復(fù)糖復(fù)氧處理,以建立腎臟缺血再灌注損傷細胞模型。于復(fù)糖復(fù)氧后不同時間點采用CCK-8法檢測細胞存活率；Annexin V/7-AAD雙標(biāo)法檢測細胞凋亡水平,western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase3、cleaved caspase3、cleaved PARP表達變化。選取上述各指標(biāo)變化最明顯的時間點分別給予硝基油酸(OA-NO2,1.25μM)或油酸(OA,1.25 μM)處理,對照組給予與給藥組相同體積的乙醇作用。然后采用CCK-8法、Annexin V/7-AAD雙標(biāo)法、Hoechst 33342染色法檢測藥物對細胞存活及凋亡的影響；Western blotting檢測藥物對凋亡相關(guān)蛋白c aspase3、 cleaved caspase3、cleaved PARP;線粒體組分和細胞質(zhì)基質(zhì)組分中Bax、Bcl2、細胞色素C(cyto C)、凋亡誘導(dǎo)因子 (AIF)； 以及存活信號通路蛋白phospho-Akt、Akt、phospho-Gsk 3β、Gsk3β蛋白表達水平的影響。免疫熒光染色檢測藥物對活化Bax表達變化的影響。最后,采用GW9662口siRNA干擾技術(shù)抑制PPARγ活性,觀察上述指標(biāo)的變化情況。2.為明確硝基油酸對缺糖缺氧／復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)處理后腎小管上皮細胞中氧化應(yīng)激損傷的作用及機制,選取人腎小管上皮細胞系(HK-2),給予缺糖缺氧16小時后復(fù)糖復(fù)氧處理。于復(fù)糖復(fù)氧后不同時間點,采用DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,選取氧化應(yīng)激水平最高的時間點分別給予硝基油酸(OA-N02,1.25μM)或油酸(O A,1.25μM)處理,對照組給予與給藥組相同體積的乙醇作用。然后采用DCFH-DA染色及DHE染色檢測藥物對損傷后細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響；JC-1染色檢測藥物對損傷后線粒體膜電位變化的影響；實時熒光定量RT-PCR及western blotting分別檢測藥物對損傷后抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、GCLM.SOD1以及NADPH氧化酶亞基NOX4、NOX2、p22phox基因及蛋白水平表達變化的影響；ABTS法檢測細胞總抗氧化能力變化；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化法檢測細胞內(nèi)NADPH氧化酶活性變化。最后,采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Nrf2基因及蛋白表達,觀察上述指標(biāo)變化。研究結(jié)果1.硝基油酸通過調(diào)控PPAR γ/Akt/Gsk-3β信號通路改善缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡1.1缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)損傷可逐步降低HK-2細胞存活率,增加細胞凋亡CCK-8結(jié)果顯示,缺糖缺氧8、16、24小時,復(fù)糖復(fù)氧24小時處理后,細胞存活率分別為80.27±0.96%、51.62±1.37%和29.00±2.69%、Annexin V/7-AAD雙標(biāo)法及western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示在缺糖缺氧16小時,復(fù)糖復(fù)氧3小時(H16R3)處理后,細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達水平最高(均P0.01),因此本實驗選取H16R3作為OGD/R模型條件。1.2硝基油酸而不是油酸提高缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)損傷后細胞存活率CCK-8結(jié)果顯示,硝基油酸(2.5或51μM)作用20小時后, 與乙醇對照組相比,細胞增殖明顯被抑制(均P0.01)；而硝基油酸(0.5,0.75,1.25μM)對細胞增殖無明顯作用。與OGD/R組相比,硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用可將細胞存活率由48.88±3.13%提升至61.17±4.90%(P0.05),而油酸并無此作用。1.3硝基油酸緩解缺糖缺氧／復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)造成的細胞凋亡Annexin V/7-AAD雙標(biāo)、Hoechst 33342染色及western blotting結(jié)果顯示：與OGD/R組相比,硝基油酸(1.25μM)預(yù)作用組細胞凋亡水平降低(P0.001)；細胞核形態(tài)得到改善；cleaved caspase 3 和 cleaved PARP表達下調(diào)(均P0.05)。1.4硝基油酸抑制缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)引起的Bax活化、線粒體轉(zhuǎn)位及繼發(fā)線粒體外膜通透性增加Western blotting分析線粒體/細胞質(zhì)基質(zhì)蛋白組分結(jié)果顯示,與正常對照組相比,OGD/R組中線粒體組分Bax水平升高,細胞色素c和AIF水平下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)；而細胞質(zhì)基質(zhì)組分Bax水平明顯下降,細胞色素c和AIF水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。與OGD/R組相比,硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組中線粒體組分Bax和細胞質(zhì)基質(zhì)組分細胞色素c和AIF水平均明顯下降(均P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示,與正常對照組相比,OGD/R組細胞中活化Bax水平明顯升高；而硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組細胞中活化Bax水平較OGD/R組明顯降低(均P0.001)。1.5硝基油酸恢復(fù)缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)后Akt及Gsk 3β的磷酸化水平Western blotting結(jié)果顯示,與正常對照組相比,OGD/R組中Akt及Gsk 3β磷酸化水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)；而硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組中Akt及Gsk 3β磷酸化水平恢復(fù)至接近正常水平。1.6 GW9662和PPARγsiRNA廢除硝基油酸對缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)后HK-2細胞的保護作用Western blotting結(jié)果顯示,與陰性對照si RNA轉(zhuǎn)染組相比,PPAR y siRNA轉(zhuǎn)染組中PPARγ蛋白表達水平明顯下調(diào)(P0.01); CCK-8及Annexin V/7-AAD雙標(biāo)結(jié)果顯示：與陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比,PPAR γ siRNA轉(zhuǎn)染組HK-2細胞增殖被抑制(P0.01),但細胞凋亡率不增加；而GW9662作用組中細胞增殖及凋亡均無明顯變化。在GW9662 (0.5 μM)預(yù)作用1小時或PPAR γ siRNA轉(zhuǎn)染后,H16R3+肖基油酸組中細胞存活率和Akt及Gsk 3β磷酸化水平降低至H16R3組水平；細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達水平增加至H16R3組水平。1.7 GW9662和PPAR γ siRNA廢除硝基油酸對缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)引起B(yǎng)ax活化的抑制作用免疫熒光結(jié)果顯示：在GW9662 (0.5預(yù)作用1小時或PPARγ染后,與H16R3組相比,H16R3+硝基油酸組中活化Bax的紅色熒光強度仍處于較高水平。2 硝基油酸通過上調(diào)抗氧化物表達和抑制NADPH氧化酶活性改善缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)引起的腎小管上皮細胞氧化損傷2.1 硝基油酸而不是油酸減輕缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)后細胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷DCFH-DA染色結(jié)果顯示,在缺糖缺氧16小時,復(fù)糖復(fù)氧4小時(H16R4)處理后,細胞內(nèi)ROS水平最高(均P0.01)。因此本實驗選取缺糖缺氧16小時(H16R0)作為OGD模型條件；缺糖缺氧16小時,復(fù)糖復(fù)氧4小時(H16R4)作為OGD/R模型條件。DCFH-DA染色、DHE染色及JC-1染色結(jié)果表明,與OGD/R組相比,相應(yīng)硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組細胞中氧化應(yīng)激水平明顯下降(P0.01),線粒體膜電位下降明顯改善,而油酸預(yù)作用組中,上述指標(biāo)無明顯變化。2.2硝基油酸上調(diào)抗氧化物表達實時熒光定量RT-PCR和western blotting檢測結(jié)果顯示,與OGD組及OGD/R組相比,相應(yīng)硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組中HO-1、GCLM、SOD1基因及蛋白表達水平明顯上調(diào)(均P0.05)。ABTS法檢測細胞總抗氧化能力結(jié)果顯示,與正常對照組相比,OGD組和OGD/R組細胞內(nèi)總抗氧化能力降低(均P0.01)。而與正常對照組、OGD組和OGD/R組相比,相應(yīng)硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組細胞內(nèi)總抗氧化能力明顯升高(均P0.05)。2.3硝基油酸上調(diào)Nrf2表達并促進其核轉(zhuǎn)位實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,正常氧濃度培養(yǎng)條件下的硝基油酸(1.25μM)作用組中Nrf2基因表達水平為乙醇對照組中的1.44+0.04倍(P0.001)。Western blotting結(jié)果顯示,與正常對照組和OGD/R組相比,相應(yīng)硝基油酸(1.25μM)預(yù)作用組中Nrf2在細胞總蛋白中的表達量分別上調(diào)了5.89倍和0.97倍(均P0.01)；在核蛋白中的表達量分別上調(diào)了2.88倍和1.18倍(均P0.05)。2.4 Nrf2 siRNA部分廢除硝基油酸介導(dǎo)的抗氧化物表達上調(diào)及抗氧化作用實時熒光定量RT-PCR和western blotting結(jié)果顯示,與陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比,Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組中,Nrf2基因及蛋白表達水平明顯下調(diào)(均P0.001)；在Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后, H16R4+硝基油酸組與H16R4組相比,HO-1及GCLM基因和蛋白表達水平無明顯上調(diào),但SOD1基因和蛋白表達水平仍被上調(diào)(P0.05)。DCFH-DA染色、ABTS法檢測細胞總抗氧化能力及JC-1染色結(jié)果表明,在Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后,H16R4+硝基油酸組與H16R4組相比,氧化應(yīng)激水平無明顯下降,總抗氧化能力無明顯提高,線粒體膜電位下降無明顯改善。2.5硝基油酸抑制缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化法檢測細胞內(nèi)NADPH氧化酶活性結(jié)果顯示,與正常對照組相比,OGD組和OGD/R組中NADPH氧化酶活性明顯升高(均P0.05)；與OGD組和OGD/R組相比,相應(yīng)硝基油酸(1.25μM)預(yù)作用組中NADPH氧化酶活性下降(均P0.05)。實時熒光定量RT-PCR和western blotting結(jié)果顯示,與OGD/R組相比,相應(yīng)硝基油酸(1.25 μM)預(yù)作用組中NOX4、NOX2、p22phox基因及蛋白表達水平下調(diào)(均P0.05)。2.6 Nrf2 siRNA未影響硝基油酸介導(dǎo)的NADPH氧化酶上調(diào)抑制作用實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,與H16R4組相比,陰性對照siRNA和Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后的H16R4+肖基油酸組中NOX4、NOX2、p22phox基因表達水平仍被下調(diào)(均P0.05)。研究結(jié)論1.硝基油酸下調(diào)缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧后HK-2細胞凋亡水平；2.硝基油酸減輕缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧后HK-2細胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷；3.硝基油酸可通過PPARγ依賴的方式激活A(yù)kt/Gsk3β通路,抑制Bax活化及其線粒體轉(zhuǎn)位,從而減少缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧造成的線粒體源性細胞凋亡。4.硝基油酸可上調(diào)SOD1和Nrf2依賴的HO-1＝GCLM表達水平,恢復(fù)抗氧化系統(tǒng)功能；抑制NADPH氧化酶激活,減少ROS生成,從而改善缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧造成的氧化應(yīng)激損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692
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本文編號：1914589