本文選題：前列腺癌 + MiR-218��； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是男性患者中最常見的因?qū)嵭云鞴賽盒阅[瘤和癌癥而致死亡的第二個主要原因。根據(jù)長期大量的流行病學(xué)等研究,前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展主要受雄激素以及飲食習(xí)慣等綜合因素的影響。而長期慢性炎癥的刺激會導(dǎo)致人類罹患癌癥的風(fēng)險大大增加,患癌的風(fēng)險比正常人增加約20%,這其中包括胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌。流行病學(xué)研究和組織病理學(xué)證據(jù)表明,PCa的發(fā)生率也與炎癥相關(guān),但是其具體的機制,至目前仍不完全被人類所認(rèn)知。基本上,由慢性炎癥最先創(chuàng)建一個環(huán)境,豐富的炎癥反應(yīng)可能會導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞因子和生長因子增殖反應(yīng)和快速分裂的基因突變的單元格。因此,PCa是與炎癥密切相關(guān)特別是與炎癥因子的作用。白細(xì)胞介素是人類體內(nèi)廣泛存在的炎癥細(xì)胞因子,其種類繁多。而白細(xì)胞介素-6(IL-6)是一款多功能炎癥因子。研究表明,細(xì)胞因子的表達(dá)及功能改變與人類的所患惡性腫瘤息息相關(guān)。白細(xì)胞介素-6也已被認(rèn)定其在PCa患者的臨床標(biāo)本中表達(dá)和Pca細(xì)胞株中廣泛存在。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)48,也被稱為富含亮氨酸重復(fù)包含GPCR(LGR)4,其是一種糖蛋白激素受體,屬于GPCR家族,并在其GPCR家族中扮演重要角色。一般情況下,LGR4將編碼GPCR偶聯(lián)蛋白之一。一項最近的研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6增強LGR4蛋白在骨肉瘤細(xì)胞的表達(dá),表明LGR4可能影響白細(xì)胞介素-6基因在腫瘤表達(dá)。此外,臨床前和臨床研究已經(jīng)證實,GPCR在PCa組織組織中高表達(dá)。LGR4的表達(dá)與多種類型的癌癥的發(fā)生相關(guān),包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌,以及肝癌的形成。LGR4對腫瘤的影響已認(rèn)識到,但目前卻對LGR4表達(dá)的調(diào)節(jié)機制目前尚不清楚。小分子RNA(mi RNA)是一套內(nèi)源性小非編碼RNA(19-22堿基的長度)。和調(diào)節(jié)基因翻譯、表達(dá)或裂解以及RNA序列的特異性相關(guān)。大量證據(jù)表明,mi RNA調(diào)節(jié)不同生物過程,包括細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞凋亡。mi RNA下調(diào)多個靶基因,包括原癌基因和抑癌基因,同時一些mi RNA功能作為腫瘤抑制因子和其他基因一起充當(dāng)原癌基因。特別是,mi R-218,在有關(guān)mi RNA抑制腫瘤發(fā)展的研究中,其已被廣泛認(rèn)為與研究的幾種類型癌癥高度相關(guān),在前列腺癌中同樣存在。在本研究中,我們即是想探討LGR4作為mi R-218的下位靶點,其是如何通過調(diào)控LGR4影響PCa細(xì)胞增殖和侵襲的。研究目的(一)分別采用實時熒光定量PCR法和ELISA法檢測mi R-218和IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增生組(BPH)、前列腺癌組織的表達(dá)水平。(二)建立了一個在IL-6低濃度下長期孵育的LNCa P-IL-6細(xì)胞亞系,采用實時熒光定量PCR法檢測mi R-218在LNCa P和LNCa P-IL-6細(xì)胞傳代過程中的表達(dá)水平趨勢。采用Brd U和Transwell法對IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6細(xì)胞系的影響進(jìn)行統(tǒng)計分析。(三)采用Western blot analysis法檢測IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6+細(xì)胞中對于LGR4蛋白表達(dá)的影響。材料與方法1.1病例選擇:選取2012年7月至2015年7月在我院診治的經(jīng)確診的58例前列腺癌患者的癌組織標(biāo)本(Pca)、51例前列腺癌患者的癌旁正常組織標(biāo)本(NP)、以及56例良性前列腺增生(BPH)患者的前列腺組織,同時均保存在-80℃冰箱內(nèi)。所有患者均經(jīng)入組標(biāo)準(zhǔn)篩選為確診病例。1.2排除標(biāo)準(zhǔn):已經(jīng)接受了內(nèi)分泌或其他治療的患者被排除。1.3實驗方法:分別采用實時熒光定量PCR法和ELISA法檢測mi R-218和IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增生組(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的表達(dá)水平;建立了一個在IL-6低濃度下長期孵育的LNCa P-IL-6細(xì)胞亞系,采用實時熒光定量PCR法檢測mi R-218在LNCa P和LNCa P-IL-6細(xì)胞傳代過程中的表達(dá)水平趨勢;采用Brd U和Transwell法對IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6細(xì)胞系的影響進(jìn)行統(tǒng)計分析;采用Western blot analysis檢測IL-6和mi R-218在LNCa P-IL-6細(xì)胞中對于LGR4蛋白表達(dá)的影響。1.4統(tǒng)計學(xué)方法:定量資料采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,測定結(jié)果以x±s表示,對RT-PCR各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,以P0.05差異為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(一)mi R-218和IL-6在各組織中的表達(dá)水平1.mi R-218在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增殖組織(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的表達(dá)水平依次降低,分別為(1.49±0.07)、(0.89±0.02)、(0.51±0.02),差異顯著(P=0.012)、(P=0.024)、((P=0.001)具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增殖組織(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的水平依次升高,分別為(1.09±0.05)、(1.89±0.01)、(2.52±0.02),差異顯著(P=0.002)、(P=0.004)、((P=0.020)具有統(tǒng)計學(xué)意義。(二)在LNCa P-IL-6細(xì)胞亞系中,長期IL-6的刺激后,LNCa P細(xì)胞中mi R-218表達(dá)水平下降,結(jié)果說明mi R-218的表達(dá)在LNCa P轉(zhuǎn)化為LNCa P-IL-6+細(xì)胞的過程中逐漸下降。(三)mi R-218阻礙IL-6誘導(dǎo)的LNCa P-IL-6細(xì)胞的增殖和侵襲。Brd U分析結(jié)果表明IL-6促進(jìn)LNCa P-IL-6細(xì)胞增殖,然而mi R-218轉(zhuǎn)染抑制了該作用。并且IL-6導(dǎo)致細(xì)胞周期中G0/G1期的細(xì)胞比例減少,相反mi-R218轉(zhuǎn)染促進(jìn)G0/G1期數(shù)目細(xì)胞的增加。Transwell的結(jié)果顯示,LNCa P-IL-6細(xì)胞的侵襲能力在使用IL-6后顯著升高,然而這一作用被mi R-218的轉(zhuǎn)染顯著抑制。(四)Western blot analysis法檢測分別受到IL-6和mi R-218影響的LNCa P-IL-6+細(xì)胞中LGR4蛋白表達(dá)水平:LGR4在IL-6誘導(dǎo)的LNCa P-IL-6細(xì)胞中相對表達(dá)量為(2.20±0.30);LGR4在mi R-218誘導(dǎo)的LNCa P-IL-6細(xì)胞中相對表達(dá)量為(0.40±0.01);LGR4在IL-6+mi R-218誘導(dǎo)的LNCa P-IL-6細(xì)胞中相對表達(dá)量為(1.30±0.21);三者之間比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。(五)RT-PCR法檢測mi R-218在mi R-218轉(zhuǎn)染后的LNCa P-IL-6+細(xì)胞系中的表達(dá)水平:在mi R-218轉(zhuǎn)染組mi R-218的相對表達(dá)量為(1.20±0.20),與對照組相比顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(六)Western blot analysis法LGR4蛋白在mi R-218轉(zhuǎn)染后的LNCa P-IL-6+細(xì)胞系中的表達(dá)水平:在mi R-218轉(zhuǎn)染組LGR4蛋白的相對表達(dá)量為(0.30±0.03),與對照組相比顯著下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論(一)在前列腺癌的病程中mi R-218的表達(dá)下調(diào),IL-6的表達(dá)上調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果示:BPH患者mi R-218的表達(dá)較正常前列腺偏低,在前列腺癌患者的表達(dá)較BPH患者偏低。然而,ELISA結(jié)果顯示IL-6水平在正常、BPH、前列腺癌患者中趨勢與上述相反。長期IL-6的刺激后,LNCa P細(xì)胞中mi R-218表達(dá)水平下降,結(jié)果說明mi R-218的表達(dá)在正常前列腺、BPH、前列腺癌的進(jìn)程中和LNCa P轉(zhuǎn)化為LNCa P-IL-6細(xì)胞的過程中逐漸下降,而IL-6逐漸升高。(二)Mi R-218阻礙IL-6誘導(dǎo)的LNCa P-IL-6細(xì)胞的增殖和侵襲。Brd U分析結(jié)果表明IL-6促進(jìn)LNCa P-IL-6細(xì)胞增殖,然而mi R-218轉(zhuǎn)染抑制了該作用。統(tǒng)計分析表明IL-6導(dǎo)致細(xì)胞周期中G0/G1期的細(xì)胞比例減少,相反mi-R218轉(zhuǎn)染促進(jìn)G0/G1期數(shù)目細(xì)胞的增加,LNCa P-IL-6細(xì)胞的侵襲能力在使用IL-6后顯著升高,然而這一作用被mi R-218的轉(zhuǎn)染顯著抑制。(三)Mi R-218抑制IL-6誘導(dǎo)的LNCa P-IL-6細(xì)胞中LGR4的表達(dá)。結(jié)果顯示LGR4在LNCa P-IL-6細(xì)胞中經(jīng)IL-6預(yù)處理后顯著增加,然而mi R-218準(zhǔn)然后完全抑制了以上變化(四)Mi R-218通過結(jié)合在LGR4 3’-UTR靶點發(fā)揮作用。生物信息預(yù)測顯示在mi R-218和LGR4的3’-UTR之間存在一個可能的結(jié)合位點。為了證實這個靶點,我們進(jìn)行了熒光素酶報告基因分析,去評估被MIR-LGR4-UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的螢光素酶活性,并與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果顯示mir-218顯著抑制LGR4-wt的表達(dá),然而LGR4-mut并無抑制效應(yīng)。此外,熒光定量PCR結(jié)果證實了mi R-218轉(zhuǎn)染促進(jìn)了LNCa P-IL-6細(xì)胞中mi R-218的成熟。此外,LGR4蛋白水平在該過程中下降�？傊�,結(jié)果顯示mi R-218直接作用于LNCa P-IL-6細(xì)胞中的LGR4位點。
[Abstract]:The expression of LGR4 is associated with inflammation . In general , the expression of LGR4 is associated with inflammation . The expression of IL - 6 and IL - 6 in LNCa P and LNCa P - IL - 6 cell lines was determined by real - time fluorescence quantitative PCR and ELISA . The effects of IL - 6 and mi R - 218 on LNCa P - IL - 6 cell lines were analyzed by means of Brd U and Transwell method . The expression levels of IL - 6 and mi R - 218 in LNCa P - IL - 6 cells were analyzed by means of real - time fluorescence quantitative PCR and ELISA . ( 2 ) In LNCa P - IL - 6 cells induced by IL - 6 in LNCa P - IL - 6 cells induced by IL - 6 , the expression levels of LGR4 in LNCa P - IL - 6 cells induced by IL - 6 were significantly higher than those in LNCa P - IL - 6 cells induced by IL - 6 . The results showed that IL - 6 inhibited the proliferation and invasion of LNCa P - IL - 6 cells in normal prostate , BPH and prostate cancer . The results showed that IL - 6 stimulated the proliferation of LNCa P - IL - 6 cells in normal prostate , BPH and prostate cancer . The results showed that the expression of LGR4 - 218 was significantly inhibited by IL - 6 in LNCa P - IL - 6 cells .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Nil Vanli;胡國富;;血管生成素與前列腺癌（英文）[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2015年12期

，

本文編號：1878815