發(fā)布時(shí)間：2018-05-05 05:37

  本文選題：氧化修飾型低密度脂蛋白 + 系膜細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的臨床上膜增生性腎小球腎炎、系膜增生性腎小球腎炎等以腎病綜合征為主要臨床表現(xiàn)的腎小球腎炎及其他各種腎臟疾病(如糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等)盡管發(fā)病原因各不相同,但其共同特點(diǎn)是患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂,主要表現(xiàn)為高血脂癥,同時(shí)常常伴發(fā)腎小球系膜細(xì)胞大量增生,在臨床過(guò)程上往往呈慢性進(jìn)展,最后發(fā)生進(jìn)行性腎小球纖維化及腎臟硬化,是導(dǎo)致慢性腎臟病(CKD)發(fā)生發(fā)展的最主要原因。近年來(lái)CKD晚期病變-終末期腎病(ESRD)已經(jīng)成為人類主要健康問題之一,在世界范圍內(nèi)CKD和ESRD發(fā)病率逐年上升。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院2004年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,近年來(lái)美國(guó)死亡率最高的惡性腫瘤、心臟病等幾種疾病的發(fā)生率正在逐漸降低,而CKD發(fā)病率卻明顯增加。研究表明美國(guó)成年人CKD的發(fā)生率約為11%,至2010年美國(guó)ESRD患病人數(shù)至少增加12萬(wàn)余人,美國(guó)全國(guó)ESRD病人達(dá)到65萬(wàn)余人,同時(shí),CKD患者伴發(fā)心腦血管疾病等明顯增加,因此隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,ESRD和CKD已經(jīng)日益成為人們需要面臨的主要健康問題。CKD的主要病理學(xué)表現(xiàn)是腎臟組織的纖維化,有研究者認(rèn)為腎小管病變導(dǎo)致的腎臟間質(zhì)纖維化在慢性腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用,尤其是糖尿病腎病等許多伴發(fā)高血脂癥的腎臟疾病患者被認(rèn)為是由脂質(zhì)引發(fā)的腎毒性作用導(dǎo)致,其機(jī)制可能涉及低密度脂蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的活化,大量脂質(zhì)沉積于腎小管內(nèi)以及釋放某些活性細(xì)胞因子等,并且認(rèn)為腎小管病變導(dǎo)致的腎臟疾病嚴(yán)重程度較腎小球病變的后果要嚴(yán)重,故近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道多集中于腎小管方面的研究,然而腎小球的病變常常導(dǎo)致腎小球率過(guò)濾及腎臟血流動(dòng)力學(xué)等的變化,這樣就會(huì)使腎小球入球小動(dòng)脈或出球小動(dòng)脈血流減少以致中斷,因此會(huì)使血供主要來(lái)自腎小球出球小動(dòng)脈的腎小管發(fā)生一系列病變?nèi)缥s變性或壞死等,所以可以認(rèn)為腎小球疾病是不少腎小管病變的觸發(fā)和始動(dòng)因素,而許多腎小管疾病則可能是來(lái)自于腎小球病變的繼發(fā)性改變。因此,有必要加強(qiáng)對(duì)腎小球疾病的相關(guān)研究。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在由各種腎小球腎炎導(dǎo)致ESRD和CKD的過(guò)程中,作為腎小球最重要固有細(xì)胞的系膜細(xì)胞在其中發(fā)揮著重要的作用,尤其是在各種損傷因素作用下,系膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象越來(lái)越引起眾多研究者的注意。系膜細(xì)胞(MsC)是腎小球內(nèi)三種固有細(xì)胞成份中功能最活躍的一種,也是腎臟疾病中各種致病因子作用的主要靶細(xì)胞。作為腎小球內(nèi)固有的血管周細(xì)胞,組織學(xué)與胚胎學(xué)研究證實(shí),腎小球系膜細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞具有同源性。與血管平滑肌細(xì)胞相似,系膜細(xì)胞在不同時(shí)期或不同狀態(tài)下具有不同的細(xì)胞亞型。在胚胎及幼體腎小球發(fā)育期,系膜細(xì)胞增殖活躍,細(xì)胞內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)陽(yáng)性,此時(shí)的細(xì)胞類型為增殖/分泌型。隨著機(jī)體腎小球的逐漸發(fā)育,成熟的系膜細(xì)胞更替速度緩慢,處于低代謝、非激活的靜息狀態(tài),細(xì)胞內(nèi)未見α-SMA表達(dá),被稱為靜止型細(xì)胞。生理情況下,處于靜止型的系膜細(xì)胞,僅行使吞噬及維持細(xì)胞外基質(zhì)正常代謝的功能,但在病理?xiàng)l件下,受外界刺激因素的影響,系膜細(xì)胞可以發(fā)生轉(zhuǎn)分化,重新變?yōu)樵鲋?分泌型細(xì)胞,此時(shí)的系膜細(xì)胞可以稱之為肌成纖維細(xì)胞(MFB),細(xì)胞骨架以表達(dá)α-SMA為主要特點(diǎn),其形態(tài)發(fā)生改變,并伴隨系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增多,逐漸發(fā)展為腎小球硬化,此為腎臟硬化形成的重要步驟,因此系膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用具有重要的生理和病理意義。眾所周知,高血脂癥是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素之一,高血脂癥中低密度脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系尤其密切。在體內(nèi)由于氧化應(yīng)激等各種病理因素的影響低密度脂蛋白非常容易被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸揎椥偷兔芏戎鞍?ox-LDL),近年來(lái)的研究結(jié)果已經(jīng)明確氧化修飾型低密度脂蛋白較低密度脂蛋白具有更強(qiáng)的致動(dòng)脈粥樣硬化作用。在由各種腎小球腎炎及糖尿病腎病導(dǎo)致的機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂中,血漿低密度脂蛋白濃度異常升高亦更加受到研究者們的注目。Virchow早在100多年前在描述Bright's腎病時(shí)就曾經(jīng)提出過(guò)“脂質(zhì)變性”這一觀點(diǎn),此后20世紀(jì)80年代英國(guó)學(xué)者M(jìn)oorhead又提出血漿脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致腎臟毒性學(xué)說(shuō),近年來(lái)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)高血脂癥與腎臟硬化有密切的關(guān)系,而腎小球纖維化與動(dòng)脈粥樣硬化在組織形態(tài)學(xué)上的改變和發(fā)生機(jī)制上有一定程度的相似性,如均表現(xiàn)為某些細(xì)胞在局部的大量增生,膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)在局部組織的聚集等。研究顯示,在氧化修飾型低密度脂蛋白致動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中血管平滑肌細(xì)胞表型的調(diào)整起著重要的作用,由此可以推測(cè)作為與血管平滑肌細(xì)胞在組織胚胎學(xué)上具有相同起源的腎小球系膜細(xì)胞,于高血脂癥條件下受氧化修飾型低密度脂蛋白刺激,在腎小球腎炎及腎小球纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能也具有重要的病理學(xué)意義。因此對(duì)系膜細(xì)胞在氧化修飾型低密度脂蛋白等病理?xiàng)l件作用下的增殖及轉(zhuǎn)分化規(guī)律進(jìn)行深入研究將有助于加深對(duì)腎小球腎炎及腎小球纖維化的發(fā)生及其慢性進(jìn)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)。事實(shí)上在腎臟疾病逐漸進(jìn)展的過(guò)程中,腎小球系膜細(xì)胞及系膜區(qū)的改變是主要的病變環(huán)節(jié),但目前對(duì)腎小管類疾病的關(guān)注程度較高,對(duì)腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用等的相關(guān)實(shí)驗(yàn)也多集中于腎小管上皮細(xì)胞與腎間質(zhì)的關(guān)系及某些炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子對(duì)系膜細(xì)胞的作用上,而對(duì)氧化修飾型低密度脂蛋白能否直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化作用及對(duì)其超微結(jié)構(gòu)的體視學(xué)分析等研究則未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在細(xì)胞水平上應(yīng)用氧化修飾型低密度脂蛋白作用于體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞,研究其對(duì)系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期變化、誘導(dǎo)系膜細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化及其對(duì)系膜細(xì)胞線粒體等超微結(jié)構(gòu)和功能的影響,探討氧化修飾型低密度脂蛋白活化的系膜細(xì)胞在腎小球腎炎及其纖維化中的作用和可能機(jī)制。方法1.大鼠系膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及ox-LDL對(duì)大鼠系膜細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞購(gòu)于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。實(shí)驗(yàn)中大鼠腎小球系膜細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置37℃, 5%CO2飽和培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以每2～3天的周期換液和傳代,取消化后的MsC培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞接近于鋪滿孔底時(shí)換無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí),使多數(shù)細(xì)胞同步于靜止期后分為空白對(duì)照組(培養(yǎng)液中不含ox-LDL)及ox-LDL誘導(dǎo)組(ox-LDL終濃度分別為25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml)于培養(yǎng)后72小時(shí)收集細(xì)胞,利用臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn),進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),觀察氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞毒性作用。2.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖水平及其細(xì)胞周期變化的影響利用四唑氮鹽(MTT)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于大鼠腎小球系膜細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)其體外增殖能力的影響;通過(guò)繪制細(xì)胞7天生長(zhǎng)曲線圖觀察氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響;利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖周期分布的影響;利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞不同時(shí)間后誘導(dǎo)其增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的情況。3.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠系膜細(xì)胞α-SMA、CTGFmRNA及其蛋白和FN、Ⅳ型膠原表達(dá)的影響利用透射式電子顯微鏡及Western Blot觀察檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于大鼠腎小球系膜細(xì)胞72小時(shí)后轉(zhuǎn)分化標(biāo)記物-α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá);利用RT-PCR 檢測(cè) α- SMAmRNA、CTGF mRNA 的表達(dá);利用 Western Blot 檢測(cè) CTGF蛋白的表達(dá);應(yīng)用ELISA檢測(cè)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FN和Ⅳ型膠原的表達(dá)。4.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠系膜細(xì)胞遷移能力及線粒體功能的影響應(yīng)用Transwell遷移法檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞72小時(shí)后對(duì)系膜細(xì)胞體外遷移能力的影響;利用檢測(cè)系膜細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性變化的方法觀察氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)線粒體功能變化的影響。5.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠系膜細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響利用透射式電子顯微鏡觀察氧化修飾型低密度脂蛋白作用于大鼠腎小球系膜細(xì)胞72小時(shí)后對(duì)細(xì)胞線粒體等超微結(jié)構(gòu)變化的影響;為研究氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞線粒體這一重要細(xì)胞器超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,對(duì)經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白(50μg/ml)作用72小時(shí)前后的系膜細(xì)胞線粒體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了體視學(xué)研究,透射電鏡下計(jì)算刺激前后系膜細(xì)胞線粒體的體積密度、表面積密度、數(shù)密度、平均體積和平均表面積。6.統(tǒng)計(jì)分析方法所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。MTT法檢測(cè)系膜細(xì)胞增殖結(jié)果采用雙因素析因方差分析,同一因素各個(gè)水平之間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),若方差齊性取F值,若方差不齊則采用Welch值,多重比較在方差齊性時(shí)采用SNK檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2法,線粒體體視學(xué)參數(shù)測(cè)試結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.大鼠腎系膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及氧化修飾型低密度脂蛋白細(xì)胞毒性作用臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,不同濃度氧化修飾型低密度脂蛋白作用72小時(shí)后,對(duì)照組及ox-LDL誘導(dǎo)組系膜細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為(0.964±0.009 ),(0.961±0.006), (0.970±0.005),(0.969±0.013),(0.965±0.012),即系膜細(xì)胞的細(xì)胞活力均在95%以上,組間均數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.641, P=0.642)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,均為對(duì)95%以上的活細(xì)胞產(chǎn)生作用,實(shí)驗(yàn)證明25～100μg/ml氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。2.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖水平及其細(xì)胞周期變化的影響系膜細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用,在培養(yǎng)后第1～3天生長(zhǎng)相對(duì)較慢,第4～6天生長(zhǎng)速度明顯加快,其后速度相對(duì)穩(wěn)定,進(jìn)入平臺(tái)期。MTT法對(duì)不同濃度氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞不同時(shí)間吸光度的測(cè)定,對(duì)照組及ox-LDL誘導(dǎo)組系膜細(xì)胞24h分別為:(0.898±0.065 ),(1.645±0.086),(2.092±0.170),(2.309±0.168),(2.572±0.057); 48h分別為:(0.956±0.059),(1.939±0.058),(2.170±0.054),(2.524±0.168), (2.745±0.055);72h分別為:(1.281±0.053),(2.484±0.245 ),(2.662±0.087),(2.765±0.131),(2.912±0.079)。析因方差分析表明,不同濃度氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞增殖結(jié)果組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.953, P0.001),氧化修飾型低密度脂蛋白作用不同時(shí)間對(duì)系膜細(xì)胞增殖組間均數(shù)的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.209, P0.001),氧化修飾型低密度脂蛋白濃度和時(shí)間雙因素之間存在交互效應(yīng)(F=2.735, P=0.022),氧化修飾型低密度脂蛋白促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖與其作用濃度和作用時(shí)間有關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞72小時(shí)后對(duì)照組和ox-LDL誘導(dǎo)組細(xì)胞周期各時(shí)相分別為:Go/G1期:(96.21±2.41)%、(93.66±0.77)%、(89.96±2.53) %、(86.92±1.68) %、(81.37±2.16) %; S期:(3.62±1.66) %、(6.05±0.72) %、(9.17±1.58) %、(12.95±1.46) %、(17.43±2.41) %。分析結(jié)果表明,不同濃度的氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞增殖周期中Go/G1期、S期組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.321, P0.001; F=44.048, P0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞72小時(shí)后對(duì)照組和ox-LDL誘導(dǎo)組增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)分別為(2.31±0.13),(6.82±0.27),(11.61 ±0.65),(18.44±0.18),(26.65±0.71),其表達(dá)結(jié)果組間均數(shù)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1764.774, P0.001)。3.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡下對(duì)照組系膜細(xì)胞表面的微絨毛積聚,數(shù)量較多,微絨毛細(xì)長(zhǎng),細(xì)胞核膜光滑平整,胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)較少。在氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72h后,系膜細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生明顯的變化。當(dāng)氧化修飾型低密度脂蛋白濃度在25～50μg/ml時(shí),系膜細(xì)胞胞體兩端稍稍突起,細(xì)胞體積逐漸增大,細(xì)胞表面仍有微絨毛存在,形態(tài)由細(xì)長(zhǎng)變?yōu)槎檀?細(xì)胞核膜內(nèi)陷,形狀不規(guī)則;當(dāng)氧化修飾型低密度脂蛋白濃度在75～100μg/ml時(shí),系膜細(xì)胞胞體逐漸延長(zhǎng)肥大,細(xì)胞表面的微絨毛數(shù)量明顯減少,形態(tài)由細(xì)長(zhǎng)變?yōu)槎檀?尤其是當(dāng)氧化修飾型低密度脂蛋白濃度達(dá)100μg/ml時(shí),系膜細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞的兩端明顯突起,細(xì)胞表面未見明顯的微絨毛,細(xì)胞漿內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)豐富,細(xì)胞內(nèi)可見明顯沿細(xì)胞核膜外分布、呈束狀排列的肌動(dòng)蛋白樣結(jié)構(gòu)。透射式電子顯微鏡顯示的系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)及其超微結(jié)構(gòu)變化表明,在氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)下,系膜細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)分化,其細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)呈典型的肌成纖維細(xì)胞特征。4.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞α-SMA、CTGF mRNA及其蛋白和FN、Ⅳ型膠原表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)系膜細(xì)胞α-SM Am RN A結(jié)果顯示其在對(duì)照組細(xì)胞中有微弱的基礎(chǔ)表達(dá)(0.210±0.015),經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)α-SMAmRNA 結(jié)果為:(0.681±0.027 )、( 0.984±0.015 )、( 1.387±0.026 )、(1.938±0.029); RT-PCR檢測(cè)系膜細(xì)胞CTGF mRNA結(jié)果顯示其在對(duì)照組細(xì)胞中有微弱的基礎(chǔ)表達(dá)(0.500±0.013),經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)CTGFmRNA結(jié)果為(0.940±0.064)、(1.210±0.011)、(1.271±0.043)、(1.473±0.035),分析表明α-SMA及CTGFmRNA表達(dá)結(jié)果組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3241.339,P0.001; F=377.897,P0.001); Western Blot檢測(cè)α-SMA蛋白結(jié)果顯示其在對(duì)照組細(xì)胞中有少量表達(dá)(0.097±0.042),經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72小時(shí)后Western Blot檢測(cè)α-SMA結(jié)果為(0.247±0.019 )、(0.452±0.068)、(0.562±0.018)、(0.758±0.073),Western Blot檢測(cè)CTGF蛋白結(jié)果顯示其在對(duì)照組細(xì)胞中有少量表達(dá)(0.086±0.035),經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72小時(shí)后Western Blot檢測(cè)CTGF結(jié)果為(0.683±0.206)、(0.986±0.153)、(1.411±0.153)、(1.747±0.057),分析表明α-SMA及CTGF蛋白表達(dá)結(jié)果組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( =108.708, P0.001; F=88.634, P0.001); ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組FN有少量表達(dá)(3.03±0.41),經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72小時(shí)后FN表達(dá)結(jié)果為(6.38±0.57)、( 10.44±0.35)、( 14.71±0.76)、( 19.23±0.59);ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組Ⅳ型膠原有少量表達(dá)(8.65±3.13)經(jīng)氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)72小時(shí)后Ⅳ型膠原表達(dá)結(jié)果為(16.01±1.89)、(25.23±2.91)、(32.95±3.30)、(38.71±2.27),分析表明FN及Ⅳ型膠原表達(dá)結(jié)果組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=539.784,P0.001; F=78.799,P0.001)。5.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠系膜細(xì)胞體外遷移能力的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞72小時(shí)后細(xì)胞體外遷移的結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)組遷移的系膜細(xì)胞數(shù)量分別為(10.25±3.50)、(19.75±4.65)、(30.00±6.00)、(42.75±4.57)、(66.25±5.56),組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.064, P0.001),說(shuō)明在氧化修飾型低密度脂蛋白作用下系膜細(xì)胞體外遷移運(yùn)動(dòng)的水平得到明顯的提升。6.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞線粒體功能的影響氧化修飾型低密度脂蛋白作用于系膜細(xì)胞72小時(shí)后,對(duì)照組和氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)組線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性檢測(cè)結(jié)果為(117.37±51.81)、(296.71±83.27)、(477.85±150.53)、(765.72±187.71)、(953.28±176.13),組間均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.435, P0.001),說(shuō)明在氧化修飾型低密度脂蛋白作用下系膜細(xì)胞線粒體功能得到加強(qiáng),可提供更多的能量以供細(xì)胞活動(dòng)需要。7.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)影響的體視學(xué)測(cè)量氧化修飾型低密度脂蛋白(50μg/ml)作用于系膜細(xì)胞72小時(shí)后,空白對(duì)照組和ox-LDL誘導(dǎo)組細(xì)胞透射電鏡10000倍觀察系膜細(xì)胞線粒體的參數(shù)值分別為:空白對(duì)照組:體積密度為(1.283±0.061 )、表面積密度(μm2/3)為(0.113±0.005 )、數(shù)密度(μm-3)為(0.047±0.005 )、平均體積(μμm3)為(2.863±0.230)、平均表面積(μm3)為(1.175±0.167)。ox-LDL誘導(dǎo)組:體積密度為(0.135±0.006 )、表面積密度(μm2/3)為(1.171±0.005) 、數(shù)密度(μm-3)為(0.499±0.004 )、平均體積(μm3)為(2.410±0.913)、平均表面積(μm3)為(6.912±0.943)。兩組各指標(biāo)組間均數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(體積密度t=83.550, P0.001;表面積密度t=-632.015,P0.001;;數(shù)密度t=-31 1.759,P0.001;平均體積t=6.749,P0.001;平均表面積t=-59.867,P0.001)。結(jié)論1.氧化修飾型低密度脂蛋白能夠促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖,該效應(yīng)可能與其刺激系膜細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原表達(dá),使系膜細(xì)胞增殖周期發(fā)生變化有關(guān);2.氧化修飾型低密度脂蛋白可以影響腎小球系膜細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及線粒體的功能;3.氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞具有轉(zhuǎn)分化作用,即系膜細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,α-SMA表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)細(xì)胞分泌FN、Ⅳ膠原等細(xì)胞外基質(zhì)以及CTGF等細(xì)胞因子;4.氧化修飾型低密度脂蛋白通過(guò)對(duì)系膜細(xì)胞的上述作用,與系膜細(xì)胞增殖性腎炎病程進(jìn)展關(guān)系密切,可以導(dǎo)致或加重腎小球纖維化,是腎小球纖維化的危險(xiǎn)因素。本研究創(chuàng)新之處1.從體外細(xì)胞培養(yǎng)的角度首次證實(shí)氧化修飾型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞的促增殖作用主要是通過(guò)促進(jìn)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá),改變細(xì)胞周期分布而實(shí)現(xiàn)的;2.首次證實(shí)氧化修飾型低密度脂蛋白可以影響系膜細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)系膜細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象;3.首次利用生物體視學(xué)的原理和方法對(duì)氧化修飾型低密度脂蛋白作用下系膜細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了定量分析,為揭示氧化型低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用的部分機(jī)制提供了支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1846464