本文選題：T279 + TSC21�。� 參考：《鄭州大學》2017年博士論文

【摘要】：第一部分:睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠模型的建立目的構建基因打靶載體,通過基因打靶技術,建立睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠模型,在活體實驗動物水平研究這兩個睪丸特異性新基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過程中的功能。方法訂購含T279基因及TSC21基因的129 BAC克隆,PCR擴增Retrieve同源臂及Loxp-neo-Loxp片段,利用PL253質粒進行目片段的連接和同源重組,構建打靶載體并電轉ES細胞,利用Southern blot方法鑒定同源重組陽性的ES細胞克隆。鑒定后的ES細胞克隆通過顯微注射的方法注入囊胚的胚泡中,再將囊胚植入假孕母鼠的子宮中發(fā)育,產生嵌合體小鼠,通過回交、互交,從出生的子代小鼠中通過genotyping技術可鑒定、篩選出純合子的T279及TSC21基因敲除小鼠,再經繁育即可建立T279及TSC21基因敲除小鼠品系。結果經過限制性內切酶酶切鑒定及DNA測序鑒定,T279及TSC21基因敲除打靶載體構建成功。Southern blot結果顯示成功篩選到打靶序列同源重組陽性的ES細胞克隆。鑒定后的ES細胞克隆注入囊胚胚泡后植入假孕母鼠的子宮中發(fā)育,順利得到嵌合體小鼠,通過回交、互交,從出生的子代鼠中鑒定并篩選出了純合子的T279及雜合子的TSC21基因敲除小鼠。結論睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠模型構建成功,繁育順利。第二部分:睪丸特異性新基因T279及TSC21在小鼠睪丸精子發(fā)生過程中的功能研究目的繁育并回交擴增睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠品系,通過表型分析,初步探索睪丸特異性新基因T279及TSC21在雄性小鼠睪丸精子發(fā)生過程中的作用,為男性不育癥的診斷和治療探索新的途徑。方法通過RT-PCR和Real-Time PCR等實驗技術,分析睪丸特異性新基因T279及TSC21在小鼠體內的表達情況,繁育并回交擴增睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠品系,通過交配實驗、子代分析、附睪精子質量分析、睪丸組織切片HE染色、生精功能評估等技術,觀察睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除缺失對雄性小鼠睪丸精子發(fā)生過程和生育能力造成的影響。結果T279基因完全敲除缺失很可能會導致雄性小鼠精子畸形率的升高,但是T279基因敲除雄性小鼠的生育能力并未受到明顯的影響。TSC21基因部分敲除對雄性小鼠的精子發(fā)生過程及生育能力沒有造成明顯的影響,目前尚沒有TSC21基因敲除純合子后代出生。結論睪丸特異性新基因T279及TCS21很可能在雄性小鼠睪丸精子發(fā)生過程中起重要的作用。T279基因完全敲除缺失很可能會導致雄性小鼠精子發(fā)生過程異常,進而引起雄性小鼠精子畸形率的升高,主要表現(xiàn)為精子頭部畸形。TSC21基因完全缺失很可能導致子代胚胎發(fā)育過程中因發(fā)育異常引起胚胎期死亡。
[Abstract]:The first part: the establishment of a new testicular specific gene T279 and TSC21 knockout mouse model to construct a gene targeting vector. Through gene targeting technique, a new testis specific gene T279 and TSC21 knockout mouse model was established, and the two new testicular specific genes in the mouse testis spermatogenesis were studied at the level of living experimental animals. Function in the process. Method order 129 BAC clones containing T279 gene and TSC21 gene, PCR amplification of Retrieve homologous arm and Loxp-neo-Loxp fragment, use PL253 plasmids to connect and reorganize the target fragments, construct targeting carrier and electrically transfer ES cells, use Southern blot method to identify homologous recombination positive ES cell clones. Identified ES The cell clones inject into the blastocyst of the blastocyst by microinjection, then the blastocyst is implanted into the uterus of the pregnant mouse, and the chimerism mice are produced. Through the backcross and intercross, the T279 and TSC21 knockout mice of the homozygote can be identified from the offspring of the birth offspring by genotyping technique, and then the T279 and TS can be established by breeding. C21 gene knockout mouse strains. Results through restriction endonuclease digestion identification and DNA sequencing identification, T279 and TSC21 gene knockout target vector construction successful.Southern blot results showed that the target sequence homologous recombinant ES cell clones were successfully screened. The identified ES cell clones were implanted into the blastocyst of the embryo and implanted into the offspring of pregnant mice. In the uterus, the chimerism mice were successfully obtained, and the T279 and heterozygote TSC21 gene knockout mice were identified and screened from the offspring of the offspring from the offspring of the offspring. Conclusion the new testes specific gene T279 and TSC21 gene knockout mice were constructed successfully, and the second part: the new testis specific gene T279 and TS The function of C21 during the spermatogenesis of testicular spermatogenesis in mice. Aim to breed and backcross the new testicular specific gene T279 and TSC21 knockout mice. Through phenotypic analysis, the role of testis specific new gene T279 and TSC21 in the spermatogenesis of male mice was preliminarily explored to diagnose and treat male infertility. To explore new ways. Methods RT-PCR and Real-Time PCR were used to analyze the expression of new testicular specific gene T279 and TSC21 in mice, propagation and backcross amplification of new testis specific gene T279 and TSC21 knockout mice, through mating experiment, progeny analysis, epididymal sperm quality analysis, testicular tissue section The effects of T279 and TSC21 knockout deletion on testicular spermatogenesis and fertility of male mice were observed by HE staining and spermatogenic function evaluation. Results the complete knockout deletion of T279 gene might lead to the increase of sperm malformation rate in male mice, but the T279 gene knockout male mice. The ability has not been significantly affected by.TSC21 gene knockout. There is no significant effect on the spermatogenesis and fertility of male mice. There is no TSC21 gene knockout homozygote birth. Conclusion the new testicular specific gene T279 and TCS21 may play an important role in the process of testicular spermatogenesis in male mice. The complete knockout deletion of.T279 gene may lead to abnormal spermatogenesis in male mice and the increase of sperm malformation rate in male mice. The main manifestation is that the complete deletion of the.TSC21 gene of the sperm head deformity may lead to the embryonic death in the development of the offspring embryo due to abnormal development.

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R698.2

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