本文選題：T279 + TSC21　； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分:睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠模型的建立目的構(gòu)建基因打靶載體,通過(guò)基因打靶技術(shù),建立睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠模型,在活體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平研究這兩個(gè)睪丸特異性新基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程中的功能。方法訂購(gòu)含T279基因及TSC21基因的129 BAC克隆,PCR擴(kuò)增Retrieve同源臂及Loxp-neo-Loxp片段,利用PL253質(zhì)粒進(jìn)行目片段的連接和同源重組,構(gòu)建打靶載體并電轉(zhuǎn)ES細(xì)胞,利用Southern blot方法鑒定同源重組陽(yáng)性的ES細(xì)胞克隆。鑒定后的ES細(xì)胞克隆通過(guò)顯微注射的方法注入囊胚的胚泡中,再將囊胚植入假孕母鼠的子宮中發(fā)育,產(chǎn)生嵌合體小鼠,通過(guò)回交、互交,從出生的子代小鼠中通過(guò)genotyping技術(shù)可鑒定、篩選出純合子的T279及TSC21基因敲除小鼠,再經(jīng)繁育即可建立T279及TSC21基因敲除小鼠品系。結(jié)果經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及DNA測(cè)序鑒定,T279及TSC21基因敲除打靶載體構(gòu)建成功。Southern blot結(jié)果顯示成功篩選到打靶序列同源重組陽(yáng)性的ES細(xì)胞克隆。鑒定后的ES細(xì)胞克隆注入囊胚胚泡后植入假孕母鼠的子宮中發(fā)育,順利得到嵌合體小鼠,通過(guò)回交、互交,從出生的子代鼠中鑒定并篩選出了純合子的T279及雜合子的TSC21基因敲除小鼠。結(jié)論睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠模型構(gòu)建成功,繁育順利。第二部分:睪丸特異性新基因T279及TSC21在小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程中的功能研究目的繁育并回交擴(kuò)增睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠品系,通過(guò)表型分析,初步探索睪丸特異性新基因T279及TSC21在雄性小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程中的作用,為男性不育癥的診斷和治療探索新的途徑。方法通過(guò)RT-PCR和Real-Time PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù),分析睪丸特異性新基因T279及TSC21在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況,繁育并回交擴(kuò)增睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除小鼠品系,通過(guò)交配實(shí)驗(yàn)、子代分析、附睪精子質(zhì)量分析、睪丸組織切片HE染色、生精功能評(píng)估等技術(shù),觀察睪丸特異性新基因T279及TSC21基因敲除缺失對(duì)雄性小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程和生育能力造成的影響。結(jié)果T279基因完全敲除缺失很可能會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠精子畸形率的升高,但是T279基因敲除雄性小鼠的生育能力并未受到明顯的影響。TSC21基因部分敲除對(duì)雄性小鼠的精子發(fā)生過(guò)程及生育能力沒(méi)有造成明顯的影響,目前尚沒(méi)有TSC21基因敲除純合子后代出生。結(jié)論睪丸特異性新基因T279及TCS21很可能在雄性小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程中起重要的作用。T279基因完全敲除缺失很可能會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠精子發(fā)生過(guò)程異常,進(jìn)而引起雄性小鼠精子畸形率的升高,主要表現(xiàn)為精子頭部畸形。TSC21基因完全缺失很可能導(dǎo)致子代胚胎發(fā)育過(guò)程中因發(fā)育異常引起胚胎期死亡。
[Abstract]:The first part: the establishment of a new testicular specific gene T279 and TSC21 knockout mouse model to construct a gene targeting vector. Through gene targeting technique, a new testis specific gene T279 and TSC21 knockout mouse model was established, and the two new testicular specific genes in the mouse testis spermatogenesis were studied at the level of living experimental animals. Function in the process. Method order 129 BAC clones containing T279 gene and TSC21 gene, PCR amplification of Retrieve homologous arm and Loxp-neo-Loxp fragment, use PL253 plasmids to connect and reorganize the target fragments, construct targeting carrier and electrically transfer ES cells, use Southern blot method to identify homologous recombination positive ES cell clones. Identified ES The cell clones inject into the blastocyst of the blastocyst by microinjection, then the blastocyst is implanted into the uterus of the pregnant mouse, and the chimerism mice are produced. Through the backcross and intercross, the T279 and TSC21 knockout mice of the homozygote can be identified from the offspring of the birth offspring by genotyping technique, and then the T279 and TS can be established by breeding. C21 gene knockout mouse strains. Results through restriction endonuclease digestion identification and DNA sequencing identification, T279 and TSC21 gene knockout target vector construction successful.Southern blot results showed that the target sequence homologous recombinant ES cell clones were successfully screened. The identified ES cell clones were implanted into the blastocyst of the embryo and implanted into the offspring of pregnant mice. In the uterus, the chimerism mice were successfully obtained, and the T279 and heterozygote TSC21 gene knockout mice were identified and screened from the offspring of the offspring from the offspring of the offspring. Conclusion the new testes specific gene T279 and TSC21 gene knockout mice were constructed successfully, and the second part: the new testis specific gene T279 and TS The function of C21 during the spermatogenesis of testicular spermatogenesis in mice. Aim to breed and backcross the new testicular specific gene T279 and TSC21 knockout mice. Through phenotypic analysis, the role of testis specific new gene T279 and TSC21 in the spermatogenesis of male mice was preliminarily explored to diagnose and treat male infertility. To explore new ways. Methods RT-PCR and Real-Time PCR were used to analyze the expression of new testicular specific gene T279 and TSC21 in mice, propagation and backcross amplification of new testis specific gene T279 and TSC21 knockout mice, through mating experiment, progeny analysis, epididymal sperm quality analysis, testicular tissue section The effects of T279 and TSC21 knockout deletion on testicular spermatogenesis and fertility of male mice were observed by HE staining and spermatogenic function evaluation. Results the complete knockout deletion of T279 gene might lead to the increase of sperm malformation rate in male mice, but the T279 gene knockout male mice. The ability has not been significantly affected by.TSC21 gene knockout. There is no significant effect on the spermatogenesis and fertility of male mice. There is no TSC21 gene knockout homozygote birth. Conclusion the new testicular specific gene T279 and TCS21 may play an important role in the process of testicular spermatogenesis in male mice. The complete knockout deletion of.T279 gene may lead to abnormal spermatogenesis in male mice and the increase of sperm malformation rate in male mice. The main manifestation is that the complete deletion of the.TSC21 gene of the sperm head deformity may lead to the embryonic death in the development of the offspring embryo due to abnormal development.

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R698.2

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本文編號(hào)：1837334