發(fā)布時(shí)間：2018-04-25 13:04

  本文選題：膀胱癌 + 腫瘤干細(xì)胞�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 膀胱癌是常見(jiàn)的威脅人類(lèi)健康的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,肌層浸潤(rùn)性膀胱癌危害尤甚。目前對(duì)浸潤(rùn)性膀胱癌最有效的治療是采用根治性全膀胱切除,但是在根治術(shù)后2年內(nèi)約有50%的患者會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,并最終死于膀胱腫瘤。膀胱癌術(shù)后容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因可能是膀胱癌的“腫瘤干細(xì)胞”沒(méi)有被清除或消滅。近年來(lái)的研究表明,腫瘤干細(xì)胞在維持腫瘤的惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等方面中起著決定性作用。雖然腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例很少,在放化療時(shí),大部分非腫瘤干細(xì)胞可被輕而易舉地殺死,但是占腫瘤組織比例很少的腫瘤干細(xì)胞卻具有頑強(qiáng)的抵抗力和增生力,自我復(fù)制出一代又一代的新生腫瘤細(xì)胞,結(jié)果導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。所以,理想的治療方法應(yīng)該是在殺死非腫瘤干細(xì)胞的同時(shí),能特異地、選擇性地、靶向性地殺死腫瘤干細(xì)胞。只有徹底殺滅或清除腫瘤干細(xì)胞才有可能治愈腫瘤。 腫瘤疫苗是通過(guò)多種方式將腫瘤抗原接種宿主體內(nèi)以獲得主動(dòng)免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗腫瘤的作用。為增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫源性,具有增強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞因子被廣泛應(yīng)用,如粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落刺激因子,它是由B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在細(xì)胞因子或炎癥刺激下產(chǎn)生,可顯著促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖分化,促進(jìn)其分泌IL-2、TNF、INF等細(xì)胞因子,更重要的是,可促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟,促進(jìn)抗原的有效遞呈,從而有效地激活免疫反應(yīng)。經(jīng)過(guò)這種錨定細(xì)胞因子的腫瘤疫苗治療后的小鼠,外周血中的CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞明顯增多,腫瘤組織中浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞也明顯增多,能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫,腫瘤細(xì)胞很大程度被殺滅,皮下腫瘤體積明顯減小,小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。 但是我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn),無(wú)論是選用何種細(xì)胞因子,不管是單獨(dú)、聯(lián)合或序貫地運(yùn)用這種錨定細(xì)胞因子的腫瘤細(xì)胞疫苗,仍然會(huì)有一部分小鼠的腫瘤在消退一段時(shí)間后又會(huì)再次生長(zhǎng),這一點(diǎn)符合腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的觀點(diǎn)。我們?cè)谇捌谥苽涞囊呙绮⒉皇悄[瘤干細(xì)胞疫苗,并沒(méi)有激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng),不能徹底殺滅腫瘤干細(xì)胞。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分離出膀胱癌干細(xì)胞,在細(xì)胞水平上運(yùn)用我們特有的蛋白質(zhì)錨定技術(shù)制備膀胱癌干細(xì)胞疫苗,促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)膀胱癌干細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng),有效地殺傷或清除膀胱癌干細(xì)胞,為今后治療和預(yù)防膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。 本研究分四部分展開(kāi)： 第一部分：膀胱癌干細(xì)胞的分離 1、研究目的 從MB49膀胱癌細(xì)胞株中分離獲得MB49膀胱癌干細(xì)胞。 2、研究方法 (1)篩選最佳無(wú)血清培養(yǎng)基 (2)有限稀釋法 (3)無(wú)血清培養(yǎng)法進(jìn)行傳代 3、研究結(jié)果 (1)篩選得到最佳無(wú)血清培養(yǎng)基即RPMI1640+EGF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)+LIF(20ng/ml)+B27(20μl/ml)+BSA(4μg/ml). (2)只有2-3%的MB49膀胱癌細(xì)胞能形成克隆球,即MB49膀胱癌干細(xì)胞MCSCs.這個(gè)結(jié)果符合腫瘤干細(xì)胞只占腫瘤組織比例很少的理論假設(shè)。 (3)細(xì)胞形態(tài)經(jīng)過(guò)多次傳代后并無(wú)變化,從形態(tài)學(xué)上證明MCSCs具有穩(wěn)定性。 4、研究結(jié)論 通過(guò)聯(lián)合運(yùn)用最佳無(wú)血清培養(yǎng)基與有限稀釋法,從MB49膀胱癌細(xì)胞株中分離獲得MB49膀胱癌干細(xì)胞。 第二部分：膀胱癌干細(xì)胞的鑒定 1、研究目的 對(duì)MB49膀胱癌干細(xì)胞進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞的功能鑒定。 2、研究方法 (1)檢測(cè)膀胱癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)、Western蛋白免疫印跡(WB)檢測(cè)CD133、CD44、OCT4、 NANOG和ABCG2。 (2)檢測(cè)膀胱癌干細(xì)胞的分化能力。 (3)膀胱癌干細(xì)胞功能學(xué)方面比較,包括體外細(xì)胞增殖能力(CCK8實(shí)驗(yàn)),體外細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力,體外細(xì)胞侵襲性能力(Transwell小室實(shí)驗(yàn)),體外細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受能力和體內(nèi)細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)。 (4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)成組t檢驗(yàn)。 3、研究結(jié)果 (1)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD133+CD44+的比例在MCSCs是19.83±0.68%,要顯著高于MB49cells的3.57±0.38%,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=36.173,P=O.000)。 (2)WB結(jié)果顯示OCT4, NANOG和ABCG2的蛋白含量在MCSCs要顯著高于MB49cells,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OCT4t=2.894, P=0.044; NANOG t=14.148, P=0.000; ABCG2t=21.866, P=O.000). (3) qPCR結(jié)果顯示CD133, CD44,OCT4和NANOG的mRNA含量在MCSCs要顯著高于MB49cells,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD133t=18.941, P=0.000; CD44t=-16.854, P=0.000; OCT4t=15.226,P=0.000; NANOG t=12.445, P=0.000) (4) MCSCs在無(wú)血清培養(yǎng)基中,呈克隆球樣懸浮生長(zhǎng)。當(dāng)把MCSCs培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清后,無(wú)法繼續(xù)保持未分化狀態(tài),在形態(tài)上分化成貼壁細(xì)胞,與常規(guī)在含血清培養(yǎng)環(huán)境中貼壁培養(yǎng)的MB49cells相似。 (5)CCK8實(shí)驗(yàn)增殖曲線顯示,在培養(yǎng)的第4,5,6天,MCSCs要顯著高于MB49cells,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=582.368, P=0.000)。MCSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。 (6)軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MCSCs所形成的克隆球形態(tài)要顯著大于MB49cells所形成的克隆球,形成的克隆球數(shù)目要顯著多于MB49cells所形成的克隆球,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.732,P=0.000)。MCSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。 (7) Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MCSCs穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目要顯著多于MB49cells穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù),二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.654,P=0.000)。MCSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲能力。 (8) Paclitaxel對(duì)膀胱癌細(xì)胞和膀胱癌干細(xì)胞均有殺滅作用。Paclitaxel濃度為100nM,1uM,10uM時(shí), MCSCs細(xì)胞存活率高于MB49cells,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1753.923, P=0.000).MCSCs對(duì)Paclitaxel表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗能力。 (9)相類(lèi)似于paclitaxel, MCSCs對(duì)cisplatin、mitomycin、doxorubicin表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗能力(F=1870.563, P=0.000; F=26460.000,P=0.000; F=371.314,P=0.000)。 (10)裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果瘤體曲線顯示,在第4,6,8周時(shí)MCSCs要顯著大于MB49cells,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F-288.012, P=O.000)。MCSCs對(duì)裸鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤能力。 (11)斷頸處死小鼠后,注射部位組織切片HE染色顯示組織結(jié)構(gòu)相似,均為膀胱癌組織。 4、研究結(jié)論 通過(guò)從表面標(biāo)志物、分化能力,功能鑒定比較后,MB49膀胱癌干細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)。 第三部分：腫瘤干細(xì)胞疫苗的制備及其生物學(xué)活性的檢測(cè) 1、研究目的 制備SA-GM-CSF的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗,并對(duì)GM-CSF的錨定效率和生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。 2、研究方法 (1) SA-GM-CSF和SA-GFP雙功能融合蛋白的制備 (2) SA-GM-CSF膜表面修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗的制備 (3)流式檢測(cè)SA-GM-CSF對(duì)MB49膀胱癌干細(xì)胞的錨定效果 (4)錨定于MB49膀胱癌干細(xì)胞表面的SA-GM-CSF的生物學(xué)活性分析 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)成組t檢驗(yàn)；雙功能融合蛋白實(shí)驗(yàn)比較,采用單因素重復(fù)測(cè)量的方差分析。 3、研究結(jié)果 (1) SA-GM-CSF融合蛋白能高效地錨定在生物素化的MB49膀胱癌干細(xì)胞表面,錨定率高達(dá)89.5±1.5%。 (2)錨定于膀胱癌干細(xì)胞表面的SA-GM-CSF雙功能融合蛋白仍具有促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞的增殖活性(F=1546.522,P=0.000),且呈劑量依賴關(guān)系。 4、研究結(jié)論 成功制備了SA-GM-CSF膜表面修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗,為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 第四部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1、研究目的 評(píng)價(jià)MB49膀胱癌干細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移性膀胱癌的治療作用。 2、研究方法 (1) C57BL/6小鼠膀胱癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型的建立,包括皮下模型和肺轉(zhuǎn)移模型。 (2)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗的預(yù)防性實(shí)驗(yàn)。 (3)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗的治療性實(shí)驗(yàn)。 (4)特異性毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(CTL)的檢測(cè)。 (5)流式檢測(cè)脾臟中成熟型樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的比例。 (6)流式檢測(cè)外周血中CD4+. CD8+T淋巴細(xì)胞的含量。 (7)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗的記憶性免疫實(shí)驗(yàn)。 (8)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗的特異性免疫實(shí)驗(yàn)。 (9)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,小鼠生存時(shí)間數(shù)據(jù),采用生存分析,用Log Rank方法進(jìn)行檢驗(yàn)；對(duì)于多個(gè)獨(dú)立樣本的均數(shù)比較,采用單因素方差分析,方差齊性檢驗(yàn),如果方差齊性時(shí),采用LSD方法進(jìn)行組間兩兩比較,如果方差不齊,用WELCH檢驗(yàn),然后用DunnettT3方法進(jìn)行組間兩兩比較；小鼠腫瘤體積的均數(shù)比較,采用重復(fù)測(cè)量的分差分析；小鼠脾細(xì)胞CTL毒性實(shí)驗(yàn)比較,采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。 3、研究結(jié)果 (1)預(yù)防性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在肺模型組中,五組總體相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng),具有顯著性差異(χ2=39.656,P=0.000)；在皮下模型組中,五組總體相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的小鼠的皮下成瘤體積小,具有顯著性差異(F=311.723,P=0.000)。 (2)治療性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在肺模型組中,五組總體相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng),具有顯著性差異(χ2=42.591,P=0.000)；在皮下模型組中,五組總體相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的小鼠的皮下成瘤體積小,具有顯著性差異(F=81.825,P=0.000)。 (3)特異性毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在肺模型組中,各實(shí)驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞對(duì)MB49膀胱癌干細(xì)胞的特異性殺傷毒性實(shí)驗(yàn)具有顯著性差異,F=6505.314,P=-0.000。不同效靶比之間也具有顯著性差異,F=2523.911,P=0.000。效靶比與組間之間有交互作用,F=558.965,P=0.000。在皮下模型組中,各實(shí)驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞對(duì)MB49膀胱癌干細(xì)胞的特異性殺傷毒性實(shí)驗(yàn)具有顯著性差異,F=2147.442,P=0.000。不同效靶比之間也具有顯著性差異,F=1387.245,P=0.000。效靶比與組間之間有交互作用,F=280.000,P=0.000。運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的淋巴細(xì)胞對(duì)MB49膀胱癌干細(xì)胞的殺傷活性與其它各組相比具有顯著性差異,其均數(shù)顯著高于其余各組。 (4)流式檢測(cè)成熟型DC的結(jié)果顯示：在皮下模型組和肺模型組中,五組總體相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的CDlle+CD80+DC細(xì)胞的含量高,具有顯著性差異(肺模型組F=333.398,P=0.000；皮下模型組F=277.693,P=0.000)。 (5)流式檢測(cè)CD4+T.CD8+T淋巴細(xì)胞的結(jié)果顯示：在皮下模型組和肺模型組中,五組總體相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的CD4T.CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例均高,具有顯著性差異(肺模型組CD4+T：F=582.514,P=0.000；CD8+T:F=154.142,P=0.000；皮下模型組CD4+T:F=248.893, P=0.000；CD8+T:F=70.438,P=0.000). (6)免疫記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的滅活MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗組的小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng),具有顯著性差異(χ2=26.800,P=0.000)。 (7)免疫特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,兩組腫瘤體積的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6009.684,P=0.000)。在第50天,兩者的腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果證實(shí)：兩者相比具有顯著性差異,對(duì)照組腫瘤體積均數(shù)顯著大于實(shí)驗(yàn)組(F=1037.441,P=0.000)。 4、研究結(jié)論 (1)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗可顯著增強(qiáng)疫苗的免疫原性,有效地激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 (2)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗可有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng),抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞,從而產(chǎn)生最大的抗腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)。 (3)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗能增強(qiáng)特異性T淋巴細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,從而有效地激活機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng)。 (4)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗可促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟,有助于腫瘤抗原的遞呈,從而可有效地激活機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)。 (5)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗顯著增加浸潤(rùn)在腫瘤組織中效應(yīng)性CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞量,從而有效地直接殺傷腫瘤干細(xì)胞。 (6)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫反應(yīng),有助于小鼠抵抗MB49膀胱癌干細(xì)胞的再次攻擊。 (7)運(yùn)用SA-GM-CSF膜修飾的MB49膀胱癌干細(xì)胞疫苗有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)抗同種腫瘤細(xì)胞(MB49膀胱癌干細(xì)胞)的特異性記憶性抗腫瘤免疫反應(yīng),能保護(hù)小鼠抵抗腫瘤的再次攻擊。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1801436