本文選題：PLCε基因 + 原核表達(dá)　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 1.構(gòu)建PLCε原核表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)、分離純化PLCε蛋白并鑒定。 2.制備兔抗PLCε蛋白抗血清，進(jìn)一步分離純化驗證其特異性，并初步在膀胱癌中應(yīng)用。 方法： 1.應(yīng)用RT-PCR從人膀胱癌細(xì)胞cDNA中克隆出氨基端PLCε基因，將此氨基端PLCε片段連接至pGEX-6P-1原核表達(dá)載體上，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/PLCε。 2.將原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/PLCε轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-PLCε重組蛋白，通過GST親和層析系統(tǒng)純化重組蛋白，鑒定所純化的重組蛋白。 3．將純化的GST-PLCε重組蛋白免疫家兔，制備家兔抗PLCε的抗血清，經(jīng)蛋白A抗體純化系統(tǒng)分離純化抗血清，ELISA檢測抗血清效價,Western blot測定其特異性。 4.利用制備的PLCε抗血清包被ELISA板，制備快速PLCε蛋白血清檢測ELISA試劑盒，檢測30例膀胱癌患者與6例正常人血清中PLCε蛋白的表達(dá)情況，初步探索PLCε抗血清在膀胱癌中應(yīng)用。 結(jié)果： 1．經(jīng)RT-PCR、基因重組、酶切及測序驗證原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/PLCε構(gòu)建成功，通過GST親和層析系統(tǒng)分離純化，得到GST-PLCε重組蛋白。 2.將純化后的GST-PLCε重組蛋白免疫家兔，經(jīng)純化獲得抗血清；ELISA效價1:16000以上；Western blot結(jié)果顯示，該抗血清與原核表達(dá)的GST-PLCε重組蛋白和人膀胱癌T24細(xì)胞株表達(dá)的PLCε蛋白特異性結(jié)合。 3.制備的抗血清包被的ELISA可以檢測到血清中PLCε蛋白的表達(dá)，膀胱癌患者血清中PLCε為5.62±2.79ng/ml高于正常對照組2.53±0.42ng/ml（P＜0.05）,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 成功構(gòu)建PGEX-6P-1/PLCε原核表達(dá)系統(tǒng)，純化獲得了較高純度的GST-PLCε重組蛋白，并以重組蛋白為免疫原，制備了兔抗PLCε的抗血清，初步用于膀胱癌的血清學(xué)檢測。PLCε的抗血清的獲得為進(jìn)一步研究PLCε蛋白功能和作用機制奠定了基礎(chǔ)，同時也為開發(fā)快速檢測膀胱癌診斷試劑盒提供了實驗數(shù)據(jù)。 目的： 1.探討HepaCAM基因在前列腺組織及細(xì)胞株中的表達(dá)，分析其表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。 2.利用腺病毒載體，過表達(dá)HepaCAM基因，，檢測其對人前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能的影響及機制探討。 方法： 1.應(yīng)用RT-PCR和Western blot等技術(shù)，檢測前列腺細(xì)胞株RWPE-1,LNCap, DU145及PC3中HepaCAM基因的表達(dá)。應(yīng)用IHC技術(shù)檢測75例前列腺組織中HepaCAM蛋白的表達(dá)情況，統(tǒng)計學(xué)分析其表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。 2.應(yīng)用WST-8試驗、FCM、劃痕試驗及Transwell等實驗技術(shù)檢測HepaCAM對前列癌LNCap, DU145和PC3細(xì)胞株增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。應(yīng)用Western blot檢測HepaCAM、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9和GAPDH等相關(guān)蛋白水平的表達(dá)。 3.應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR和Western blot等技術(shù)，檢測過表達(dá)HepaCAM后前列腺癌LNCap細(xì)胞中AR的mRNA和蛋白水平的影響。應(yīng)用Western blot和ELISA技術(shù)檢測HepaCAM對其胞質(zhì)及分泌型PSA的影響。應(yīng)用EGF處理細(xì)胞后，Western blot檢測HepaCAM對癌細(xì)胞P-ERK及t-ERK等蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1. HepaCAM基因在LNCap, DU145和PC3細(xì)胞中表達(dá)缺失，在前列腺癌組織中的表達(dá)與BPH及正常前列腺組織相比顯著降低，且與前列腺癌各臨床參數(shù)間均無相關(guān)性。 2. HepaCAM基因能夠抑制前列腺癌LNCap, DU145和PC3細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。體外過表達(dá)HepaCAM后能夠降低Bcl-2、MMP2和MMP9的表達(dá)，增加Bax的表達(dá)水平。 3.細(xì)胞免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，HepaCAM可以抑制前列腺癌LNCap的AR核轉(zhuǎn)移，降低AR的表達(dá)。Western blot和ELISA檢測PSA表達(dá)明顯下降。HepaCAM可以阻滯ERK的磷酸化表達(dá)水平。 結(jié)論: 在前列腺癌中HepaCAM低表達(dá)，過表達(dá)HepaCAM可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相關(guān)分子機制可能是HepaCAM抑制前列腺癌AR的核轉(zhuǎn)位和ERK磷酸化來實現(xiàn)的。因此，HepaCAM基因缺失對臨床判斷前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有指導(dǎo)意義，為腫瘤的生物治療提供新的分子靶點。
[Abstract]:Objective:
1. construction of prokaryotic expression system of PLC epsilon. Expression, isolation and purification of PLC epsilon protein and identification.
2. preparation of Rabbit anti PLC epsilon protein antiserum, further separation and purification to verify its specificity, and preliminary application in bladder cancer.
Method錛

本文編號：1781724