本文選題：前列腺癌 + 地錢素M��； 參考：《山東大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：前列腺癌(prostate cancer, PCa)是常見的男性惡性腫瘤,在西方發(fā)達(dá)國家發(fā)病率高,僅次于肺癌。我國雖是前列腺癌發(fā)病率較低的國家,但近年來隨著人口老齡化、飲食生活習(xí)慣、環(huán)境因素等變化,其發(fā)病率迅速升高。 前列腺癌是雄激素/雄激素受體依賴性腫瘤,因此通過睪丸切除、或使用抗雄激素藥物等降低體內(nèi)的雄激素水平而進(jìn)行的內(nèi)分泌治療是治療前列腺癌的首選方案,但大多數(shù)患者會(huì)在治療后一年左右復(fù)發(fā),并發(fā)展成為激素難治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer, HRPC)。HRPC具有較強(qiáng)的抗凋亡能力,易侵襲轉(zhuǎn)移,預(yù)后差、死亡率高。盡管已對(duì)HRPC的演變進(jìn)行了諸多深入系統(tǒng)的研究,但機(jī)制仍不完全清楚,也無有效的治療策略。因此研究HRPC的惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)依然是任重而道遠(yuǎn)。除了雄激素/雄激素受體依賴途徑、非依賴途徑在HRPC發(fā)生發(fā)展中的重要作用,近年來,慢性炎癥在前列腺癌的發(fā)生、HRPC的演變過程中的重要性日益凸顯。由于前列腺癌幾乎都發(fā)生在外周區(qū),與慢性前列腺炎的發(fā)生部位相同。在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的基因, MIC-1(Macrophage Inhibitory Cytokine-1, or growth differentiation factorl5), RNASEL, MSR-1(macrophage scavenger receptor1), TLR-4(Toll-like receptors4)等,因其基因型的改變參與前列腺癌的發(fā)生。而在前列腺癌惡性發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤微環(huán)境中促炎細(xì)胞因子IL-6, TNF-a, IL-1等,發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活增殖、血管形成的作用。其中IL-6是關(guān)鍵因子,可誘導(dǎo)產(chǎn)生Thl7的CD4+T細(xì)胞,后者拮抗具有腫瘤抑制作用的Thl CD4+T細(xì)胞；作為具有促瘤作用的炎性因子,IL-6可通過IL-6/gp130激活STAT3途徑發(fā)揮促細(xì)胞增殖、抗凋亡作用。臨床資料顯示,IL6、MIC-1在轉(zhuǎn)移性的前列腺癌患者血清中表達(dá)水平顯著升高,在前列腺腫瘤的惡性發(fā)展過程中可能具有重要作用。另外,兩條重要的炎癥中樞信號(hào)途徑IKK/NF-κB、JAK/STAT3,同時(shí)也是細(xì)胞增殖存活信號(hào),在HRPC中均高表達(dá)、持續(xù)活化,與HRPC的抗凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后差密切相關(guān)。因此,慢性炎癥反應(yīng)通過NF-κB、STAT3等信號(hào)促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生,而持續(xù)活化的NF-κB、STAT3進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子如IL6,形成循環(huán)活化,促進(jìn)HRPC的形成,導(dǎo)致HRPC患者血清中IL6水平顯著升高。 炎癥反應(yīng)與前列腺癌化療耐受的研究報(bào)道不多。已發(fā)現(xiàn)HRPC患者血清中IL-6、MIC-1水平增高與多西紫杉醇的耐藥有關(guān)。由于慢性、復(fù)發(fā)性炎癥在前列腺腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、藥物耐受等方面都發(fā)揮重要作用,因此,靶向炎癥因子及其相關(guān)通路的治療策略具有重要的理論和臨床意義。如利用人源化的單克隆抗IL-6抗體CNTO328阻斷IL-6作用,能顯著抑制激素依賴前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖,同時(shí)抑制移植瘤生長。同樣,趨化因子CCL2可促進(jìn)巨噬細(xì)胞在腫瘤的浸潤及極化為M2型,利用抗CCL2的抗體以及聯(lián)用多西紫杉醇能顯著提高HRPC的治療效果并延長生存期。 近年來,我們重點(diǎn)對(duì)源自苔蘚植物的雙聯(lián)芐(Bisbibenzyls)化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的生物活性篩選,發(fā)現(xiàn)這類化合物毒性較低、具有良好的抗真菌、抗腫瘤活性。同時(shí)也對(duì)潛力化合物進(jìn)行較為深入的作用機(jī)制研究、結(jié)構(gòu)修飾、衍生物制備等。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),某些聯(lián)芐化合物可能具有一定的抗炎活性�；谏鲜鲅芯�,本論文對(duì)51種聯(lián)芐化合物及其衍生物、結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的抗炎活性篩選,并通過結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、化合物的理化性質(zhì)分析其與抗炎活性的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)片葉苔素類化合物抗炎活性較弱,而地錢素類聯(lián)芐化合物特別是地錢素M(Marchantin M, Mar M)的抗炎活性顯著,而且Mar M可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)合基因表達(dá)差異譜芯片數(shù)據(jù)及機(jī)制分析,發(fā)現(xiàn)Mar M可顯著上調(diào)G蛋白信號(hào)途徑調(diào)節(jié)蛋白4(Regulators of G-protein signaling4, RGS4), RGS4可抑制MMPs的表達(dá)、進(jìn)而在侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。并且抑制IL6信號(hào)可更為顯著增加Mar M誘導(dǎo)的RGS4的表達(dá)。本論文將分兩部分研究Mar M的抗炎、抑制前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。 第一部分地錢素M抑制促炎因子的表達(dá),提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性 本課題組前期已對(duì)幾百個(gè)聯(lián)芐化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選,并對(duì)部分潛力化合物進(jìn)行了較為深入的機(jī)制研究。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)個(gè)別雙聯(lián)芐化合物可能具有一定的抗炎活性。本論文首先利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和外周血單核細(xì)胞(PBMC)為篩選模型,對(duì)51種聯(lián)芐化合物進(jìn)行了抗炎活性的篩選,其中也包括部分具有抗腫瘤活性的聯(lián)芐化合物、衍生物、結(jié)構(gòu)修飾化合物。發(fā)現(xiàn)地錢素M具有顯著的抗炎活性,而且對(duì)腫瘤細(xì)胞的促炎因子也同樣具有良好的效果。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.地錢素類化合物具有良好的抗炎活性 我們利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和外周血單核細(xì)胞(PBMC)為模型,以經(jīng)典的促炎因子IL6為檢測(cè)指標(biāo),對(duì)兩種結(jié)構(gòu)類型(片葉苔素類、地錢素類)的51種聯(lián)芐化合物及其衍生物進(jìn)行抗炎活性分析。ELISA和定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,地錢素類雙聯(lián)芐化合物可以有效抑制HUVEC細(xì)胞中IL6的表達(dá),而片葉苔素類化合物對(duì)IL6的表達(dá)無顯著影響。其中地錢素M的抑制IL6的活性最為顯著。 2.地錢素M抑制多種炎癥因子的表達(dá) 抗炎活性篩選結(jié)果表明,地錢素M在所有篩選化合物中活性最高,對(duì)IL6的抑制率為34.3%,顯示出良好的抗炎活性。ELISA和定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明,地錢素M可以顯著抑制HUVEC中ILlβ、IL6和CCL2的表達(dá),且具有濃度和時(shí)間依賴性。PBMC細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后炎癥因子表達(dá)增加,而地錢素M可顯著抑制LPS刺激后的IL1β、IL6和CCL2的表達(dá),片葉苔素化合物的抑制作用較弱。MTT結(jié)果顯示,地錢素M具有抗炎作用的實(shí)驗(yàn)條件(作用濃度和時(shí)間)對(duì)正常的HUVEC細(xì)胞的增殖并無明顯的抑制作用,進(jìn)一步證實(shí)地錢素M可顯著抑制促炎因子的表達(dá)。 3.地錢素M顯著抑制腫瘤細(xì)胞促炎因子的表達(dá) 由于地錢素M具有良好的抗腫瘤活性,我們進(jìn)一步分析地錢素M是否對(duì)腫瘤細(xì)胞也具有抗炎活性。激素非依賴的前列腺癌PC3細(xì)胞表達(dá)較高水平的炎癥因子,地錢素M顯著下調(diào)細(xì)胞中IL1β、IL6和TNFa的表達(dá)、抑制炎性因子的分泌,且呈時(shí)間和劑量依賴性。同樣,地錢素M能夠顯著下調(diào)激素非依賴的前列腺癌DU145細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞、肺癌H460細(xì)胞、以及結(jié)直腸癌HT一29細(xì)胞中IL6的表達(dá)和蛋白分泌,表明地錢素M對(duì)腫瘤細(xì)胞也具有良好的抗炎活性。 4.地錢素M的抗炎機(jī)制分析 由于地錢素M對(duì)多種促炎因子均有抑制作用,而炎癥的中樞信號(hào)IKK/NF-κ B、JAK/STAT3在HRPC中均高表達(dá)、持續(xù)活化,與HRPC的抗凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),NF-κB/STAT3同時(shí)也是重要的轉(zhuǎn)錄因子,可介導(dǎo)多種下游靶基因的表達(dá)。因此我們分析NF-κB/STAT3信號(hào)通路是否參與地錢素M介導(dǎo)的抗炎活性。 (1)地錢素M顯著抑制LPS刺激后的HUVEC中p50和p65的表達(dá)：NF-κB與DNA的結(jié)合能力是其發(fā)揮作用的重要方式。NF-κB中的兩個(gè)亞基p50和p65的DNA結(jié)合活性檢測(cè)結(jié)果表明, HUVEC細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后p50和p65的DNA結(jié)合能力顯著增加,而地錢素M可顯著抑制p50和p65的結(jié)合活性、抑制NF-κ B的轉(zhuǎn)錄激活功能。 (2)地錢素M顯著抑制腫瘤細(xì)胞中IκBα/NF-κB的活化：Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,地錢素M不僅可以抑制PC3細(xì)胞(NF-κB基礎(chǔ)表達(dá)水平高)中NF-κB亞基p65的磷酸化,也可抑制NF-κB的抑制因子Ⅰκ B α的磷酸化水平。同時(shí),地錢素M也可顯著抑制H460和HT-29細(xì)胞(NF-κB基礎(chǔ)表達(dá)水平低)中經(jīng)LPS誘導(dǎo)激活的p65和I K B α的磷酸化水平,表明地錢素M可抑制持續(xù)活化、或者誘導(dǎo)激活的NF-κB的活性。 (3)地錢素M可能是通過抑制IKK的活性進(jìn)而抑制NF-KB的活性：在PC3細(xì)胞中,利用干擾RNA下調(diào)IκBα的表達(dá)后,可略微逆轉(zhuǎn)地錢素M抑制p65磷酸化的作用,表明I K B α可能不是地錢素M抑制p65活性的主要靶點(diǎn)。此結(jié)果提示,地錢素M可能部分抑制了IKK的活性,從而導(dǎo)致I K B α磷酸化水平降低、依賴磷酸化降解的I K B α降解減少并抑制NF-κB的活化。 (4)地錢素M顯著抑制STAT3的活化：STAT3是位于NF-κB/IL6信號(hào)通路下游的重要介質(zhì),Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,地錢素M不僅可以抑制PC3細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平,還可抑制H460和HT-29細(xì)胞中經(jīng)LPS刺激后顯著上調(diào)的phospho-STAT3。而干擾iκBa后,并不顯著逆轉(zhuǎn)地錢素M對(duì)STAT3的磷酸化抑制作用,表明地錢素M也可通過其它機(jī)制抑制STAT3的活化。 5.地錢素M的抗炎活性可增加前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性 由于多西紫杉醇可顯著增加腫瘤細(xì)胞中IL6的表達(dá),我們利用流式分析技術(shù)檢測(cè)地錢素M的抗炎活性是否能夠提高細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。結(jié)果顯示,單純使用中和抗體可封閉IL6介導(dǎo)的信號(hào),但并不顯著增加PC3和DU-145細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。而聯(lián)用地錢素M和多西紫杉醇后,細(xì)胞的凋亡率明顯上升。另外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著多西紫杉醇作用濃度的加大,PC3和DU-145的生存率逐漸降低,而若聯(lián)用地錢素M后,對(duì)細(xì)胞的生存能力產(chǎn)生非常顯著的協(xié)同抑制作用。因此,地錢素M對(duì)多種促炎因子的抑制作用可顯著增加前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。 第二部分地錢素M通過上調(diào)RGS4、下調(diào)MMPs的表達(dá)而抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移 由于促炎細(xì)胞因子IL-6, TNF-a, IL-1等對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移等都具有顯著的促進(jìn)作用。因此,本論文第二部分將分析具有抗炎活性的地錢素M對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 研究表明,G蛋白信號(hào)途徑調(diào)節(jié)蛋白(Regulators of G-protein signaling, RGS)家族成員和腫瘤的血管生成、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等諸多活動(dòng)有密切關(guān)聯(lián)。其中RGS4被報(bào)導(dǎo)在乳腺癌和卵巢癌中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性程度呈負(fù)相關(guān),該蛋白在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中表達(dá)上調(diào)可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)RGS4在前列腺癌中的表達(dá)和功能。前期的基因表達(dá)差異譜數(shù)據(jù)顯示,地錢素M可影響多個(gè)RGS蛋白的表達(dá),本論文也將探討RGS4是否參與地錢素M抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程,并初步分析IL6是否也參與其調(diào)節(jié)過程。 1.地錢素M顯著抑制PC3細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力 前期結(jié)果表明,地錢素M能非常顯著的抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們首先確定地錢素M對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明,地錢素M可以顯著抑制PC3細(xì)胞遷移的距離和轉(zhuǎn)移到下室的細(xì)胞數(shù)量。而且其抑制細(xì)胞移動(dòng)的作用顯著高于多西紫杉醇(可增加IL6表達(dá))、無抗炎活性的順鉑。 2.地錢素M顯著上調(diào)RGS4的表達(dá) 基因芯片分析結(jié)果顯示,地錢素M對(duì)18種RGS基因的表達(dá)都有較大影響。其中RGS4上調(diào)2.26倍。定量PCR驗(yàn)證結(jié)果表明,地錢素M可以顯著上調(diào)RGS4的表達(dá)。另外,Western blotting實(shí)驗(yàn)和定量PCR結(jié)果表明,RGS4在前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE1中高表達(dá),在惡性程度較低的激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP中表達(dá)量較高,在惡性程度較高的激素非依賴性前列腺癌PC3和DU-145中表達(dá)量低,提示我們RGS4的表達(dá)量高低可能與前列腺癌的惡性程度有關(guān)。 3.地錢素M上調(diào)RGS4的同時(shí)顯著下調(diào)MMP7和MMP16 由于NF-κ B的下游靶基因如MMPs等具有促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用,我們分析地錢素M對(duì)MMPs表達(dá)的影響。惡性程度較高的PC3和DU145細(xì)胞經(jīng)地錢素M處理后,細(xì)胞內(nèi)MMP7和MMP16的mRNA水平顯著下調(diào),同時(shí)Western blotting也顯示地錢素M顯著抑制MMP7和MMP16的蛋白水平,同時(shí),也明顯上調(diào)RGS4的表達(dá)。 4.RGS4能顯著增強(qiáng)地錢素M對(duì)細(xì)胞MMP7和MMP16表達(dá)的抑制作用 我們將質(zhì)粒pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)入PC3細(xì)胞使其過表達(dá)RGS4,再經(jīng)地錢素M處理,結(jié)果顯示,高表達(dá)RGS4可以抑制MMP7和MMP16的表達(dá),再與地錢素M聯(lián)用后,MMP7和MMP16的下調(diào)趨勢(shì)變得更為明顯。此結(jié)果表明,RGS4可抑制MMPs的表達(dá),可增強(qiáng)地錢素M抑制細(xì)胞遷移的作用。 5.RGS4顯著增強(qiáng)地錢素M對(duì)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RGS4可以顯著抑制PC3細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力,而過表達(dá)RGS4后細(xì)胞再經(jīng)地錢素M處理后,PC3細(xì)胞遷移的距離和轉(zhuǎn)移到下室的細(xì)胞數(shù)量下降更加明顯。因此,RGS4可負(fù)調(diào)控細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)地錢素M的抑制作用。 第三部分結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn) 一、結(jié)論 1.地錢素類雙聯(lián)芐化合物可顯著抑制正常細(xì)胞和多種惡性腫瘤細(xì)胞的促炎因子活性。 2.地錢素M顯著抑制NF-κB/IL6/STAT3信號(hào)通路。 3.地錢素M的抗炎活性提高了前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。 4.在半數(shù)抑制濃度下,具有抗炎活性的地錢素M比無抗炎活性的多西紫杉醇、順鉑具有更為顯著的抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。 5.上調(diào)RGS4參與地錢素M抑制MMP7和MMP16表達(dá)、抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 二、創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處 1.首次報(bào)導(dǎo)地錢素M具有顯著抗炎活性,且地錢素M介導(dǎo)的抗炎活性可能是由于抑制NF-κB/IL6/STAT3信號(hào)通路而增強(qiáng)多西紫杉醇的功效。但該化合物抗炎活性的動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)行。 2.首次報(bào)導(dǎo)地錢素M通過下調(diào)MMP7和MMP16的表達(dá)顯著抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC3的侵襲轉(zhuǎn)移,但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 3.首次報(bào)導(dǎo)RGS4通過下調(diào)MMP7和MMP16的表達(dá)顯著抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：1775764