本文選題：膜性腎病 + 抗磷脂酶A2受體抗體　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 構(gòu)建真核重組質(zhì)粒,體外表達(dá)PLA2R蛋白；運(yùn)用雙抗夾心原理建立抗PLA2R抗體的間接免疫熒光檢測(cè)方法(IIFT)；通過檢測(cè)MN患者血清和尿液抗PLA2R抗體,觀察血清和尿液抗體與患者疾病嚴(yán)重程度和組織病理改變的相關(guān)性。 方法： 1.PLA2R真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白表達(dá) 基因庫(kù)查找PLA2R全長(zhǎng)mRNA序列,合成全長(zhǎng)基因,構(gòu)建pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-IRES2-eGFP和pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-His重組質(zhì)粒。通過Lipofectamine2000介導(dǎo)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,進(jìn)行目的蛋白表達(dá),運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)、免疫熒光、免疫組化和WB方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。 2.抗PLA2R抗體IIFT的建立與驗(yàn)證 用表達(dá)目的蛋白的HEK293T細(xì)胞作為捕獲抗原與MN患者血清中的抗PLA2R抗體進(jìn)行結(jié)合,再用二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記,建立抗PLA2R抗體IIFT。用自建的抗體檢測(cè)方法對(duì)150例腎小球疾病患者和30例健康成人血清進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)用國(guó)外檢測(cè)試劑盒作為對(duì)照,評(píng)價(jià)自建檢測(cè)方法的有效性,明確抗體對(duì)原發(fā)性MN患者的診斷特異性。 3.抗PLA2R抗體在MN中的臨床研究 收集長(zhǎng)征醫(yī)院114例原發(fā)性MN和18例存在繼發(fā)因素MN患者的血清、尿液,用自建的抗PLA2R抗體IIFT對(duì)患者血清和尿液進(jìn)行定性檢測(cè),記錄患者的臨床資料和病理報(bào)告,采用聚合免疫散射法對(duì)患者血清IgG和IgG4進(jìn)行定量檢測(cè)。觀察原發(fā)性MN患者血清抗體陽(yáng)性組和陰性組的臨床指標(biāo)和病理的差異性,并對(duì)血清IgG和IgG4值進(jìn)行分析；將血清抗體陽(yáng)性的原發(fā)性MN患者分為尿液陽(yáng)性組和陰性組,觀察兩組患者臨床指標(biāo)和病理分期的差異性。對(duì)存在繼發(fā)因素MN患者的血清和尿液抗體進(jìn)行檢測(cè),觀察抗體的陽(yáng)性率。 結(jié)果： 1.選取基因庫(kù)中PLA2R的1型轉(zhuǎn)錄體全長(zhǎng)mRNA(NCBI,NM_007366.4)作為目的基因,合成全長(zhǎng)堿基序列,通過酶切手段構(gòu)建PLA2R的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-IRES2-eGFP和pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-His,運(yùn)用Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,通過免疫組化、流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)、免疫熒光和WB方法鑒定PLA2R蛋白的表達(dá)。 2.用表達(dá)PLA2R蛋白的HEK293T細(xì)胞作為捕獲抗原,建立抗PLA2R抗體的IIFT。用該方法對(duì)150例腎小球疾病患者和30例健康成人血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果抗體僅出現(xiàn)在原發(fā)性MN患者血清中,其它腎小球疾病和健康成人均為陰性,自建檢測(cè)方法與國(guó)外試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致。 3.114例原發(fā)性MN患者有84例(73.68%)血清抗體陽(yáng)性,陽(yáng)性組血清白蛋白、甘油三酯、肌酐、IgG、24h蛋白尿、尿TRF、IGU、eGFR和組織病理分期與陰性組存在差異(p0.05),而血清膽固醇、IgG4及IgG4/IgG值間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；18例存在繼發(fā)因素的MN患者有6例血清抗體陽(yáng)性。血清抗體陰性患者的尿液抗體均陰性,84例血清陽(yáng)性患者有60例(71.42%)尿液抗體陽(yáng)性,占總例數(shù)的52.63%；尿液陽(yáng)性組血清白蛋白、肌酐、尿TRF、IGU和eGFR與陰性組存在差異(p0.05),而血脂、24h蛋白尿、血清IgG、IgG4、 IgG4/IgG和組織病理無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)；6例存在繼發(fā)因素、血清抗體陽(yáng)性的MN患者有4例尿液抗體陽(yáng)性。 結(jié)論： 本課題構(gòu)建的PLA2R真核重組質(zhì)粒能表達(dá)PLA2R蛋白,自建的抗PLA2R抗體IIFT能有效檢測(cè)MN患者的抗PLA2R抗體。檢測(cè)抗PLA2R抗體可以作為診斷原發(fā)性MN的一種方法,其在原發(fā)性MN血清中的陽(yáng)性率為73.68%,在尿液中陽(yáng)性率為52.63%；抗PLA2R抗體在存在繼發(fā)因素的MN患者血清中有部分陽(yáng)性,但未在其他腎小球疾病和健康人群血清中檢測(cè)到。血清抗體與患者的臨床指標(biāo)顯著相關(guān),而尿液抗體可能與患者腎功能損傷程度有關(guān),抗體的出現(xiàn)提示患者臨床病情和腎臟損傷程度加重。
[Abstract]:Purpose :

constructing eukaryotic recombinant plasmid and expressing PLA2R protein in vitro ;
The indirect immunofluorescence assay ( IIFT ) of anti - PLA2R antibody was established by using double anti - sandwich principle .
The correlation of serum and urine antibodies to the severity of disease severity and histopathological changes was observed by detecting anti - PLA2R antibodies in serum and urine of MN patients .

Method :

Construction of eukaryotic recombinant plasmid of 1 . PLA2R and expression of protein

The recombinant plasmid pcDNA3.1 / Hygro - PLA2R - IRES2 - eGFP and pcDNA3.1 / Hygro - PLA2R - His were constructed by Lipofectamine 2000 - mediated transfection .

2 . Establishment and Verification of Anti - PLA2R Antibody IIFT

The anti - PLA2R antibody was used as capture antigen to bind to the anti - PLA2R antibody in serum of MN patients . The anti - PLA2R antibody IIFT was established by means of self - established antibody detection method .

3 . Clinical study of anti - PLA2R antibody in MN

The serum and urine of patients with primary MN and 18 cases of primary MN and 18 patients with secondary factors were collected , and the patients ' serum and urine were qualitatively detected by self - constructed anti - PLA2R antibody IIFT . The clinical data and pathological report of patients were recorded . The clinical indexes and pathological differences of serum antibody positive group and negative group were observed in patients with primary MN .
The serum and urine antibody of MN patients with secondary factors were detected and the positive rate of antibody was observed .

Results :

1 . The full - length mRNA of the 1 - type transcripts of PLA2R in the gene bank was selected as the target gene , and the full - length base sequence was synthesized . The eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 / Hygro - PLA2R - IRES2 - eGFP and pcDNA3.1 / Hygro - PLA2R - His were constructed by restriction enzyme digestion . The recombinant plasmid was transiently transfected with pcDNA3.1 / Hygro - PLA2R - IRES2 - eGFP and pcDNA3.1 / Hygro - PLA2R - His , and the expression of PLA2R protein was identified by immunohistochemistry , flow cytometry , immunofluorescence and WB .

2 . The expression of PLA2R protein was used as capture antigen to establish IIFT of anti - PLA2R antibody . Using this method , 150 patients with glomerular disease and 30 healthy adult sera were tested . The results showed that the antibody only appeared in serum of primary MN patients , and other glomerular diseases and healthy adult sera were negative , and the self - built test method was consistent with the test results of foreign kits .

3 . There were 84 cases ( 73.68 % ) of patients with primary MN ( 73.68 % ) . The serum albumin , triglyceride , creatinine , IgG , 24h proteinuria , urine trf , IGU ( IGU ) were significantly different from those in the negative group ( P < 0.05 ) , but there was no significant difference between the serum cholesterol , IgG and IgG values ( p < 0.05 ) .
Among the 18 patients with secondary factors , there were 6 serum antibody positive . The urine antibody was negative in serum antibody negative patients , and there were 60 ( 71.42 % ) urine antibody positive in 84 patients with positive serum antibody , accounting for 52.63 % of the total number of patients .
There was no significant difference in serum albumin , creatinine , urine trf , IGU in urine positive group and negative group ( P < 0.05 ) .
Among the 6 cases , there were secondary factors , and there were 4 positive urine antibodies in the MN patients with positive serum antibody .

Conclusion :

The monoclonal anti - PLA2R antibody could be used as a method for the diagnosis of primary MN . The positive rate of anti - PLA2R antibody in primary MN serum was 73.68 % and 52.63 % in urine .
The anti - PLA2R antibody was partially positive in the serum of MN patients with secondary factors , but was not detected in other glomerular diseases and healthy population serum . The serum antibody was significantly correlated with the patient ' s clinical index , and the urine antibody may be related to the degree of renal impairment of the patient , and the presence of the antibody suggests that the patient ' s clinical condition and the degree of kidney injury are aggravated .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：1766266