本文選題：DD3基因 + 前列腺癌��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：背景前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤,在歐美國家,PCa發(fā)病率高居男性惡性腫瘤之首。由于我國人口老齡化以及診斷技術不斷提高,PCa的發(fā)病率以每年10%的速度攀升,嚴重威脅著中老年男性的健康。然而,PCa的發(fā)病機制十分復雜,PCa發(fā)生以及進展過程中諸多影響因素尚未闡明,制約著PCa的有效診治。近年來,前列腺癌抗原3(differential display code 3 for prostate cancer, DD3)與前列腺癌的關系越來越受到人們的重視。(1)長鏈非編碼RNA與PCa長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是長度超過200個核苷酸、并具有調(diào)控基因的表達作用的非編碼RNA。越來越多的研究表明,lncRNA參與細胞凋亡、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等過程,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著促癌或抑癌的作用；lncRNA還可以通過表觀遺傳調(diào)控的方式影響腫瘤細胞的生長,從而有希望成為新型腫瘤標志物并成為腫瘤治療的靶點,同時lncRNA在腫瘤診斷和腫瘤治療方面顯示出廣闊的臨床應用前景。DD3是目前發(fā)現(xiàn)的一種PCa組織中高表達的一種lncRNA,與PCa關系密切,在對PCa的診斷效能上其敏感性和特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的PSA,有良好的臨床應用前景。(2)DD3與PCaDD3基因是在1999年由Bussemakers等發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異性基因,位于人類染色體9q21～22。DD3基因不表達蛋白,但它與前列腺癌的發(fā)生密切相關,它特異性的高表達于人類約95%的前列腺癌細胞,而在正常前列腺和良性前列腺增生細胞中僅僅少量表達或無表達。有研究發(fā)現(xiàn),DD3的基因表達用于鑒別前列腺癌和前列腺良性病變的準確性可達100%。前列腺以外的惡性及良性病變則沒有DD3的表達。這說明DD3基因是目前為止鑒別前列腺惡性腫瘤的最特異腫瘤標記物。與PSA不同,DD3基因不受患者年齡、前列腺體積及其它如前列腺炎等前列腺疾病的影響。同時有研究發(fā)現(xiàn),DD3基因表達與前列腺癌的腫瘤體積、病理分期以及病理的Gleason評分呈明顯相關,且在患者的腫瘤體積0.5mL和Gleason評分≥7的病例中,DD3基因表達呈明顯升高。在一項前列腺癌預后的多因素研究分析中,DD3基因被認為可以成為前列腺癌預后分析的獨立預測因子。有研究表明,結(jié)合患者PSA以及Gleason評分,DD3預測前列腺癌是否存在腫瘤包膜外侵犯的準確率可達90%。而對于Gleason評分較低、低PSA值和低DD3基因表達的前列腺癌患者,臨床上可以僅給予密切的監(jiān)測隨訪,等待觀察。PCa患者尿液中的細胞和細胞碎片能檢測出DD3的高表達,劉光香等人運用RT-PCR技術研究發(fā)現(xiàn),在臨床54例PCa患者中,其外周血DD3 mRNA表達陽性者48例,另有23例前列腺增生患者和9例健康成年男性外周血未見DD3mRNA的陽性表達[15]。這可能是前列腺癌患者血液中的淋巴細胞吞噬了前列腺癌細胞,從而血液中可檢測到DD3 mRNA的表達。DD3基因是長鏈非編碼RNA,而目前多種證據(jù)表明lncRNA在多種腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了非常重要的作用。DD3作為一種不表達蛋白的lncRNA,在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中的具體作用以及DD3對前列腺癌增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響目前仍不明確,有待進一步研究。目的通過細胞學、分子生物學及動物模型構(gòu)建等技術從體內(nèi)和體外兩方面系統(tǒng)的探討DD3基因?qū)τ谇傲邢侔┥L、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響,為我們進一步研究DD3基因在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制打下良好的基礎,為前列腺癌的臨床診療提供新的線索和方向。方法我們采用在體外培養(yǎng)前列腺癌研究中較常用的LNCaP細胞株和PC3細胞株。然后采用實時定量PCR技術測定LNCaP細胞株與PC3細胞株的DD3基因表達水平,并通過小RNA干擾技術(siRNA)和基因過表達技術構(gòu)建DD3敲減質(zhì)粒和DD3過表達質(zhì)粒及其對應的對照質(zhì)粒,慢病毒包裝質(zhì)粒后,通過細胞轉(zhuǎn)染建立DD3低表達的LNCaPDD3-細胞株和DD3高表達的PC3DD+細胞株及兩者的對照組細胞株LNCaPNC和PC3Ctrl。然后采用細胞計數(shù)法和MTT方法檢測所構(gòu)建的前列腺癌細胞株LNCaPDD3-、LNCaPNC、PC3DD+和PC3Ctrl的細胞增殖能力,從而確定DD3對前列腺癌細胞的增殖能力的影響；用ABL-N誘導前列腺癌細胞株LNCaPDD3+、LNCaPNC、PC3DD+和PC3Ctrl凋亡后,運用Annexin V+PI雙染法檢測各組細胞株的早、中晚期的凋亡情況,并確定DD3基因在前列腺癌細胞凋亡中的作用；運用劃痕實驗和Transwell小室進一步檢測上述各前列腺癌細胞株的遷移以及侵襲能力,確定DD3基因在前列腺癌細胞遷移、侵襲中的作用。在體內(nèi)實驗中,我采用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測上述各組細胞株在體內(nèi)形成的種植瘤的體積、重量,然后將前列腺癌瘤體石蠟包埋、切片,并利用免疫組化染色法檢測瘤體組織細胞中Ki67蛋白的表達水平；并利用TUNEL法檢測前列腺癌腫瘤組織細胞的凋亡水平；進一步研究DD3在體內(nèi)對前列腺癌細胞增殖及凋亡的影響。結(jié)果1.q-PCR檢測結(jié)果表明,用RNAi技術特異性的沉默LNCaP細胞內(nèi)的DD3的表達后,與對照組LNCaPNC細胞相比,干擾后LNCaPDD3-細胞內(nèi)DD3的表達顯著降低(P0.01)；而過表達DD3后的PC3DD3+細胞內(nèi)的DD3的表達水平顯著高于對照組PC3Ctrl細胞(P0.01)。證明LNCaPDD3-和PC3DD+細胞株建立成功。2.細胞計數(shù)法和MTT方法檢測LNCaPDD3-和PC3DD+細胞相對于其對照細胞LNCaPNC和PC3Ctrl的增殖能力,結(jié)果表明,DD3低表達的LNCaPDD3-細胞的增殖速度明顯低于其對照組LNCaPNC細胞(P0.05)；而DD3高表達PC3DD3+細胞的增殖速度明顯高于其對照組pC3Ctrl細胞(P0.05)。3. Annexin V+PI雙染法檢測前列腺癌各細胞株凋亡情況的結(jié)果顯示：DD3低表達的LNCaPDD3-細胞株的抗凋亡能力顯著低于對照組LNCaPNC細胞(P0.01)；而DD3高表達的PC3DD3+細胞的抗凋亡能力明顯高于對照組PC3Ctrl細胞(P0.01)。4.劃痕實驗和Transwell小室檢測DD3基因?qū)η傲邢侔┘毎倪w移、侵襲能力的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DD3低表達的LNCaPDD3-細胞的遷移和侵襲能力明顯低于對照組LNCaPNc細胞(P0.05)；而DD3高表達的PC3DD3+細胞的遷移和侵襲能力明顯高于對照組PC3Ctrl細胞(P0.05)。5.測量裸鼠成瘤實驗所獲得的LNCaPDD3-與LNCaPNC,PC3DD+與pC3Ctrl種植瘤的體積和重量發(fā)現(xiàn)DD3低表達的LNCaPDD3-組種植瘤體積和瘤重均小于對照組LNCaPNC(P0.01);而DD3基因高表達的PC3DD3+組種植腫瘤的體積和瘤體重量均大于對照組PC3Ctrl(P0.01)。對瘤體組織采用TUNEL法檢測組織細胞凋亡水平和免疫組化染色方法檢查細胞增殖標志物Ki67蛋白表達水平的結(jié)果發(fā)現(xiàn)DD3低表達的LNCaPDD3-組種植腫瘤中組織細胞的凋亡水平明顯高于對照組LNCaPNC(P0.05);而腫瘤組織細胞的增殖能力也明顯小于對照組LNCaPNC(P0.05)；DD3高表達的PC3DD3+組腫瘤組織細胞的凋亡水平明顯低于對照組PC3Ctrl(P0.05);而腫瘤組織細胞的增殖能力明顯大于對照組PC3Ctrl(P0.05)。結(jié)論(1)DD3基因參與了前列腺癌細胞體外生長的調(diào)控,可促進前列腺癌細胞在體外的增殖、遷移和侵襲能力,能提高前列腺癌細胞體外抗凋亡能力。(2)DD3參與調(diào)控前列腺癌細胞的體內(nèi)成瘤能力,可以促進前列腺癌細胞在體內(nèi)的增殖能力和提高癌細胞在體內(nèi)的抗凋亡能力。(3)進一步深入研究DD3在前列腺癌細胞中的作用機制可為前列腺癌的早期診斷和研制新的靶向治療藥物提供重要幫助。
[Abstract]:Background Prostate cancer ( PCa ) is a common malignant tumor in male urinary system . In European and American countries , the incidence of PCa is higher than that of male malignant tumor . In recent years , the incidence rate of PCa is increasing at 10 % per year , which severely threatens the health of middle - aged and old men .
DD3 gene is a kind of prostate cancer specific gene which is highly expressed in human chromosome 9q21 - 22 . DD3 gene is not expressed in human chromosome 9q21 - 22 . DD3 gene is not expressed in human chromosome 9q21 - 22.DD3 . The effect of DD3 gene on the growth , apoptosis , metastasis and invasion of prostate cancer cells was investigated by means of cell counting and MTT assay .
The apoptosis of prostate cancer cell line LNCaPDD3 + , LNCaPNC , PC3DD + and PC3Ctrl was induced by ABL - N , and the apoptosis of early and middle and late stages of each group was detected by annexin V + PI double staining method , and the role of DD3 gene in the apoptosis of prostate cancer cells was determined .
In vivo experiments , the volume and weight of the tumor cells formed in the above - mentioned groups of cell lines were detected by the experiments in nude mice , then paraffin of prostate cancer tumor was embedded and sectioned , and the expression level of Ki - 67 protein in tumor tissue cells was detected by immunohistochemistry staining .
TUNEL method was used to detect the apoptosis level of prostate cancer tissue cells .
Results 1.q - PCR assay showed that the expression of DD3 in LNCAPDD3 - cells was significantly lower than that of control group ( P0.01 ) .
The expression level of DD3 in PC3DD3 + cells after overexpression of DD3 was significantly higher than that of control group PC3Ctrl ( P0.01 ) . The proliferation ability of LNCaPDD3 - and PC3DD + cells was demonstrated by MTT assay .
The proliferation rate of PC3DD3 + cells was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . The results showed that the anti - apoptotic ability of the LNCaPDD3 - cell line with low DD3 expression was significantly lower than that of the control group ( P0.01 ) .
The anti - apoptotic ability of DD3 + cells was significantly higher than that of control group PC3Ctrl ( P0.01 ) . 4 . The migration and invasion ability of DD3 gene to prostate cancer cells was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) .
Compared with control group , the tumor volume and tumor weight of LNCaPDD3 - group were significantly higher than those in control group ( P 0.01 ) , and the tumor volume and tumor weight of PC3DD3 + group were significantly higher than those in control group ( P 0.01 ) .
Conclusion ( 1 ) DD3 gene is involved in the regulation of prostate cancer cell proliferation , migration and invasion ability , and can promote the proliferation , migration and invasion ability of prostate cancer cells in vitro .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

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本文編號：1754793