本文選題：休克 + 失血性��； 參考：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：嚴(yán)重創(chuàng)傷、失血、失液、燒傷、手術(shù)意外、交通事故以及包括地震等自然災(zāi)害在內(nèi)的多種嚴(yán)重致病因素,均可引起機(jī)體有效循環(huán)血量減少,導(dǎo)致失血性休克(hemorrhagic shock, HS)的發(fā)生。失血性休克后腎損傷引起的內(nèi)環(huán)境紊亂,成為失血性休克導(dǎo)致多器官損傷或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明,失血性休克狀態(tài)下腸淋巴液回流至全身,是引起多器官損傷的重要發(fā)病機(jī)制；以腸淋巴管結(jié)扎或腸淋巴液引流為手段減少腸淋巴液回流,可減輕失血性休克后的急性腎損傷(acute kidney injury, AKI),其機(jī)制涉及降低自由基、一氧化氮、促炎介質(zhì)的生成與釋放、提升細(xì)胞膜泵活性、減少細(xì)胞凋亡、減少經(jīng)腸淋巴途徑的細(xì)菌內(nèi)毒素移位(bacteria/endotoxin translocation, BET)等方面。腸淋巴液回流加重AKI或者減少腸淋巴液回流減輕AKI的機(jī)制,還需要深入觀察。 目的： 本研究旨在已明確腸淋巴液回流是失血性休克后AKI重要發(fā)病機(jī)制的工作基礎(chǔ)上,應(yīng)用基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),觀察腸淋巴管結(jié)扎對失血性休克大鼠腎組織基因表達(dá)譜以及腸淋巴液引流對失血性休克大鼠腎組織蛋白表達(dá)譜的影響,篩選失血性休克后腸淋巴液引起AKI的差異表達(dá)基因與差異表達(dá)蛋白,深入揭示淋巴液在失血性休克后AKI發(fā)病機(jī)制中的作用,為以淋巴為靶向防治重癥休克及其引起的AKI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。 方法： 1)腸淋巴管結(jié)扎對失血性休克大鼠腎組織基因表達(dá)譜的影響 Wistar雄性大鼠20只,隨機(jī)分為休克組與休克腸淋巴管結(jié)扎組,全身麻醉后,在無菌手術(shù)下,行左側(cè)頸總動(dòng)脈和右側(cè)頸靜脈插管,備監(jiān)測平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure, MAP)放血與液體復(fù)蘇；腹部手術(shù),鈍性分離腸淋巴管與腸系膜上動(dòng)脈,備腸淋巴管結(jié)扎或假結(jié)扎；待所有手術(shù)完成穩(wěn)定10min后,應(yīng)用自動(dòng)抽注機(jī)自頸總動(dòng)脈緩慢放血(失血量以全血量的1/5計(jì),全血量以體重1/13計(jì)),3min完成；通過放血或輸血,維持低血壓(40mmHg)90min,復(fù)制失血性休克模型。隨后,將放出的全血與林格氏液(量為全血量)混合,應(yīng)用自動(dòng)推注機(jī)經(jīng)右側(cè)頸靜脈緩慢勻速回輸,進(jìn)行液體復(fù)蘇,速度50mL/h,時(shí)間≥20mmin。輸液復(fù)蘇后休克腸淋巴管結(jié)扎組行腸淋巴管結(jié)扎,休克組僅在腸淋巴管下穿線；于輸液復(fù)蘇后3h,于深麻醉狀態(tài)下,留取左腎。然后,制備勻漿,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,制備Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA探針,與包含12028種基因的大鼠全基因組cDNA芯片雜交,分析差異表達(dá)基因。另取6只大鼠,再次復(fù)制失血性休克模型,并實(shí)施腸淋巴管結(jié)扎技術(shù),留取腎組織,提取RNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)方法驗(yàn)證部分差異基因表達(dá)。 2)腸淋巴液引流對失血性休克大鼠腎組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)的影響 健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠27只,隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、休克組、休克引流組(n=9)。大鼠在戊巴比妥鈉全身麻醉后,行股部手術(shù),分離右側(cè)股靜脈和股動(dòng)脈,插管后用于液體復(fù)蘇和MAP監(jiān)測；然后,分離左側(cè)股動(dòng)脈后插管,通過注射器連接于抽注機(jī)上備放血。隨后,游離腸淋巴管(mesenteric lymph duct, MLD),備腸淋巴液引流或假引流。待穩(wěn)定30min后,經(jīng)左股動(dòng)脈、應(yīng)用抽注機(jī)緩慢勻速放血,10min內(nèi)將MAP降至40mmHg,實(shí)驗(yàn)過程中通過推注機(jī)調(diào)整放血量維持MAP在(40±2) mmHg水平,復(fù)制失血性休克模型。維持低血壓60min后,將放出全血加等量林格氏液通過微量輸液泵經(jīng)右股靜脈行液體復(fù)蘇,30min完成。輸液結(jié)束后180min,休克+引流組行腸淋巴管插管,常規(guī)方法引流腸淋巴液。在深麻醉狀態(tài)下,于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),收集每只大鼠的左側(cè)腎臟,保存于-80℃低溫冰柜中,應(yīng)用二維熒光差異凝膠電泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2-DIGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。操作步驟如下：制備腎組織勻漿,去高豐度蛋白并應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)驗(yàn)證,第一向等電聚焦(isoelectric focusing, IEF),第二向SDS-PAGE,銀染,掃描與數(shù)據(jù)處理,凝膠考染。選擇表達(dá)升高或降低1.5倍的差異蛋白,進(jìn)行胰蛋白酶消化,點(diǎn)靶后,采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight, MALDI-TOF)進(jìn)行質(zhì)譜分析與鑒定。進(jìn)一步,應(yīng)用ELISA技術(shù)鑒定部分差異蛋白。 結(jié)果： 1)腸淋巴管結(jié)扎對失血性休克大鼠腎組織基因表達(dá)譜的影響 在大鼠腎組織基因組轉(zhuǎn)錄水平,獲得了5,812個(gè)有效數(shù)據(jù)。其中,兩組基因轉(zhuǎn)錄變化在2倍以上的基因個(gè)數(shù)有56個(gè),腸淋巴管結(jié)扎引起了失血性休克大鼠腎組織的25個(gè)基因上調(diào)、31個(gè)基因下調(diào)。 在腸淋巴管結(jié)扎上調(diào)失血性休克腎組織的25個(gè)基因中,有11個(gè)為已知基因,包括：視錐蛋白樣1(visinin-like1, Vsnl1)、G耦聯(lián)蛋白P2Y1嘌呤受體(purinergic receptor P2Y, G-protein coupled,1, P2ry1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)亞家族D成員2(ATP-binding cassette, subfamily D (ALD), member2, Abcd2)、溶質(zhì)載體家族13成員5(solute carrier family13(sodium-dependent citrate transporter), member5, Slc13a5)、與鉀通道4超極化相關(guān)活化環(huán)核苷酸(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel4, Hcn4)、FMS相關(guān)的酪氨酸激酶1(FMS-related tyrosine kinase1, Flt1)、巨噬細(xì)胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, Mif)、泛素化特異酶7(ubiquitin specific peptidase7, USP7)、輸入蛋白5(importin5, Ipo5)、突觸小泡蛋白1(synaptophysin-like1, Sypl1)、富含半胱氨酸與組氨酸區(qū)域(cysteine and histidine-rich domain (CHORD)-containing1, Chordc1),這些上調(diào)基因編譯的蛋白功能涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。 在腸淋巴管結(jié)扎下調(diào)失血性休克腎組織的31個(gè)基因中,有23個(gè)為已知基因,包括：切割蛋白(cutA divalent cation tolerance homolog, Cuta)、γ氨基丁酸受體相關(guān)蛋白(GABA(A) receptor-associated protein, Gabarap)、kruppel樣因子6(kruppel-like factor6, Klf6)、RNA聚合酶II多肽L (polymerase (RNA) Ⅱ (DNA directed) polypeptide L, Polr2I)、RNA聚合酶II多肽E(polymerase (RNA) Ⅱ (DNA directed) polypeptide E, Polr2e)、核酸內(nèi)切酶G (endonuclease G, Endog)、尿調(diào)節(jié)素(uromodulin, Umod)、延胡索二酰乙酰水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,Fah)、蛋白磷酸酶1(protein phosphatase1, catalytic subunit, alpha isozyme, Ppplca).線粒體F1片段ATP合成酶(ATP synthase, H+transporting, mitochondrial F1complex, delta subunit, Atp5d)、硫代硫酸鹽硫基轉(zhuǎn)移酶(thiosulfate sulfurtransferase, Tst)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase, Gss)、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶m1(glutathione S-transferase mu1, Gstm1)、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶p1(glutathione S-transferase pi1, Gstp1)、跨膜蛋白150A(transmembrane protein150A, Tmem150a)、線粒體內(nèi)膜移位酶(translocase of inner mitochondrial membrane13homolog (yeast), Timm13)、葉酸受體1(folate receptor1, Folr1)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1, Ccndl)、核糖核酸酶K (ribonuclease, RNase K, Rnasek)、鈣黏蛋白2(cadherin2, Cdh2)、激肽釋放酶相關(guān)蛋白酶C7(kallikrein1-related peptidase C7, Klk1c7).脫氧核糖核酸酶1(deoxyribonuclease1, Dnase1)、WAS蛋白家族1(WAS protein family, member1, Wasf1),這些下調(diào)基因編譯的蛋白功能涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝、運(yùn)輸、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì)胞成分和生物發(fā)生等。 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,腸淋巴管結(jié)扎降低了失血性休克大鼠腎組織Cdh2、 Gss、Tst mRNA表達(dá),提高了Mif mRNA表達(dá)；研究結(jié)果與DNA芯片結(jié)果是一致的。 2)腸淋巴液引流對失血性休克大鼠腎組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)的影響 獲取了5張IPG膠條用于后面的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,經(jīng)DeCyder6.5軟件處理,發(fā)現(xiàn)了大約2,000左右的蛋白斑點(diǎn)。經(jīng)過生物信息學(xué)模塊分析,發(fā)現(xiàn)在失血性休克組與假手術(shù)組大鼠腎組織的差異蛋白表達(dá)中,有5個(gè)蛋白斑點(diǎn)灰度超過或低于1.5倍；在休克+引流組與假手術(shù)組中,有12個(gè)差異表達(dá)蛋白表達(dá)上調(diào)或下調(diào)；在休克+引流組與休克組中,有3個(gè)差異表達(dá)蛋白表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。通過視覺觀察,去除冗余蛋白,有14個(gè)蛋白斑點(diǎn)被選擇用于MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定分析。9個(gè)蛋白斑點(diǎn)被成功鑒定,這些蛋白經(jīng)過功能分類為：細(xì)胞增殖、能量代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞骨架；其它5個(gè)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定后,有效積分值未超過59。 與假手術(shù)組比較,失血性休克組大鼠腎組織的不均一核糖核酸核蛋白C(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C, hnRNPC)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白(serine-threonine kinase receptor-associated protein, Strap)表達(dá)降低；失血性休克引流腸淋巴液腎組織的線粒體三功能酶亞基α (trifunctional enzyme subunit alpha, mitochondrial, Hadha)、溶解載體家族25成員13(solute carrier family25, member13, Slc25a13)、線粒體的ATP合酶亞基β (ATP synthase subunit beta, mitochondrial, Atp5b)、肌動(dòng)蛋白(actin)的多種亞基[如：骨胳肌源的actin a (actin, alpha skeletal muscle, Actal)、腸平滑肌源的actin γ (actin, gamma-enteric smooth muscle, Actg2)、33kDa蛋白(33kDa protein, Actg1)、前肽樣actin γ1(actin, gamma1propeptide-like, LOC684969)]、40S的核糖體蛋白S3(40S ribosomal protein S3, Rps3)以及hnRNPC與Strap均顯著降低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),失血性休克引流腸淋巴液的腎組織肌動(dòng)蛋白(actin)的多種亞基[如：心肌源的actin α1(actin, alpha cardiac muscle1, Actc1)、大動(dòng)脈平滑肌源的actin (actin, aortic smooth muscle, Acta2)、細(xì)胞質(zhì)的actin1(actin, cytoplasmic1, Actb)以及Actg2]以及Atp5b顯著低于休克組。 ELISA驗(yàn)證結(jié)果顯示,在失血性休克組與假手術(shù)組之間,腎組織Atp5b與Actg2水平無顯著差異；休克+引流組腎組織Atp5b與Actg2水平均顯著低于失血性休克組與假手術(shù)組。 結(jié)論： 1)本研究應(yīng)用DNA芯片分析技術(shù),查找、篩選、發(fā)現(xiàn)了結(jié)扎腸淋巴管阻斷腸淋巴液回流可引起失血性休克后腎組織的34個(gè)已知基因出現(xiàn)差異表達(dá),這些差異表達(dá)基因編碼蛋白的功能主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝、運(yùn)輸、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì)胞成分和生物發(fā)生等方面。研究結(jié)果提示,腸淋巴管結(jié)扎減輕失血性休克腎損傷的機(jī)制與上調(diào)或下調(diào)和上述功能相關(guān)基因的差異表達(dá)有關(guān)。 2)本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),經(jīng)質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)了失血性休克后腎組織出現(xiàn)了一些差異表達(dá)的蛋白,腸淋巴液引流也降低了一些差異蛋白的表達(dá)。這些蛋白的功能涉及細(xì)胞增殖、能量代謝、細(xì)胞骨架與運(yùn)動(dòng)等。研究結(jié)果提示,這些差異表達(dá)的蛋白可能與失血性休克引起的急性腎損傷有關(guān),也可能參與了腸淋巴液引流減輕急性腎損傷的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692;R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1742695