本文選題：腎透明細胞癌 + miR-193b-3p��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:腎細胞癌是全球成人泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。由于早期局限性腎細胞癌患者往往沒有明顯的癥狀和體征,容易造成腎細胞癌腫瘤的漏診。數(shù)據(jù)顯示大約有三分之一的患者在首次診斷為腎細胞癌時就已經(jīng)伴有遠處轉移。而一旦處于晚期轉移性腫瘤階段,患者的預后是很差的。在腎細胞癌中,透明細胞型腎細胞癌是最常見的腎細胞癌組織學類型,也是其中侵襲性最強、致死率最高的腫瘤類型。因此對于腎透明細胞癌轉移發(fā)生過程中的機制以及涉及其中的關鍵分子進行研究,對于腎透明細胞癌進一步分子分型以及未來針對性的阻止腫瘤轉移發(fā)生的治療是非常有意義以及臨床應用價值的。miRNAs是一類已經(jīng)得到大量研究證實的,能夠在多種腫瘤的發(fā)生、進展、耐藥等生物進程中起重要作用的分子類型。之前的很多其他腫瘤中的研究已經(jīng)報道了miR-193b-3p是一個重要的能夠發(fā)揮抑癌作用的miRNA分子,miR-193b-3p在很多腫瘤組織中均發(fā)生了下調表達。本課題研究中,我們通過miRNAs表達譜芯片技術,在不同轉移狀態(tài)的腎透明細胞癌腫瘤組織之間,通過篩選差異表達的miRNAs分子時發(fā)現(xiàn)miR-193b-3p在伴有轉移的腎透明細胞癌腫瘤組織中顯著下調表達。進一步通過臨床大樣本的組織驗證分析,我們證實了miR-193b-3p在mi RNAs表達譜芯片中的結果。接著我們結合收集的腎透明細胞癌患者的臨床病理參數(shù)、隨訪資料等明確了miR-193b-3p的表達量具有作為腎透明細胞癌預后預測分子的作用。接著在細胞表型水平和動物體內進一步驗證了miR-193b-3p能夠抑制腎透明細胞癌的增殖和轉移的能力,并確定了在腎透明細胞癌中miR-193b-3p潛在的靶向基因。材料和方法:1、我們依據(jù)腎細胞癌患者首次術前診斷時是否明確診斷存在遠處轉移,分為原發(fā)轉移和原發(fā)非轉移兩組,選取術后病理確認為透明細胞型的腎細胞癌患者的腫瘤組織病灶,每組3例,利用miRNAs表達譜芯片技術,進而篩選出兩組間miRNAs的表達量存在著顯著差異的miRNA分子。2、我們應用qRT-PCR的方法,將mi RNAs表達譜芯片篩選出的存在差異表達的miR-193b-3p,在原發(fā)轉移和原發(fā)非轉移腎透明細胞癌組織及其與之匹配的癌旁組織之間進行大樣本量的實驗驗證,并且結合隨訪收集的腎透明細胞癌患者的臨床病理資料以及患者的隨訪資料,分析miR-193b-3p的表達量與腎透明細胞癌患者的一些常見的臨床病理參數(shù)以及患者預后之間的關系。3、接著在體外細胞學層面,我們應用miR-193b-3p的抑制劑miR-193b-3p inhibitor和模擬劑mir-193b-3pmimics分別轉染786-o和achn細胞株進行體外實驗,采用慢病毒構建穩(wěn)定過表達的mir-193b-3p載體進行體內實驗。通過cck-8實驗、westernblot實驗、brdu實驗、克隆形成實驗探討mir-193b-3p對于腎癌細胞株增殖能力的作用,并通過裸鼠皮下荷瘤觀察腫瘤生長以及對移植瘤進行免疫組化染色進一步確認。此外我們通過體外腫瘤細胞劃痕實驗、transwell遷移和侵襲實驗探討mir-193b-3p對于腎癌細胞株的遷移和侵襲能力的影響,并在建立尾靜脈注射腎癌肺轉移動物模型上通過體外熒光成像和肺組織he染色進一步觀察mir-193b-3p對于腎癌轉移的影響。4、接著我們結合轉錄組芯片中差異表達的mrna以及mirna靶向預測工具,應用雙熒光素酶報告系統(tǒng)、qrt-pcr實驗、westernblot實驗、免疫熒光檢測實驗,探討了在腎透明細胞癌中mir-193b-3p可能的下游靶向基因。研究結果:1、在原發(fā)轉移的腎透明細胞癌和原發(fā)非轉移的腎透明細胞癌腫瘤組織之間,通過mirnas表達譜芯片篩選出差異表達的mirnas共27個,其中下調表達12個,上調表達15個。結合差異表達倍數(shù)(foldchange)、錯誤發(fā)現(xiàn)率(fdrvalue)以及相關文獻調研,選定mir-193b-3p進行進一步研究。2、根據(jù)qrt-pcr檢測結果分析,我們發(fā)現(xiàn)mir-193b-3p在腎透明細胞癌組織中呈現(xiàn)顯著的低表達(p0.05),并且在原發(fā)轉移的腎透明細胞癌腫瘤組織中進一步降低(p0.05)。另外結合腎透明細胞癌患者的臨床病理資料,我們發(fā)現(xiàn)mir-193b-3p的下調表達與臨床晚期、高pt分級以及腫瘤陽性轉移狀態(tài)呈現(xiàn)顯著相關。kaplan-meier生存分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中低表達mir-193b-3p的腎透明細胞癌患者的術后腫瘤容易發(fā)生疾病進展、患者的預后生存較差。cox多因素風險回歸模型分析進一步分析發(fā)現(xiàn)mir-193b-3p的表達水平能夠作為腎透明細胞癌患者疾病進展和生存的獨立預后危險因素。3、cck-8實驗發(fā)現(xiàn),轉染了mir-193b-3pinhibitor能夠顯著的增強腎癌細胞株的增殖能力,而轉染mir-193b-3pmimics則顯著的抑制了腎癌細胞株的增殖能力。westernblot實驗發(fā)現(xiàn)轉染mir-193b-3pinhibitor能夠增強ki-67以及pcna這兩個細胞增殖能力特異性抗原的表達,而轉染mir-193b-3pmimics則顯著抑制了ki-67和pcna的表達。brdu實驗發(fā)現(xiàn)敲減mir-193b-3p能夠增加brdu陽性細胞比率,而過表達mir-193b-3p則減少了brdu的陽性細胞比率。細胞克隆形成實驗也發(fā)現(xiàn)敲減mir-193b-3p會增加腎癌細胞的集落形成,而過表達mir-193b-3p則會減少腎癌細胞的集落形成。裸鼠體內實驗中,我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達mir-193b-3p能夠顯著地抑制裸鼠皮下荷瘤的生長。通過對裸鼠皮下荷瘤進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)ki-67、PCNA以及CD31的表達顯著受到了抑制。4、細胞劃痕實驗表明轉染了miR-193b-3p inhibitor的腎癌細胞劃痕愈合能力顯著增加,而轉染了mi R-193b-3p mimics的腎癌細胞劃痕能力則顯著收到了抑制。Transwell遷移和侵襲實驗表明敲減miR-193b-3p的腎癌細胞株的遷移和侵襲能力得到了顯著的增強,而過表達miR-193b-3p則顯著抑制了腎癌細胞株的遷移和侵襲能力。通過尾靜脈注射腎癌細胞建立肺轉移模型發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定過表達miR-193b-3p能夠顯著性地抑制腎癌肺微轉移灶的形成。5、雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗證實了mi R-193b-3p能夠直接靶向MCL1、MMP19和E2F6的3'UTR區(qū)域。qRT-PCR實驗、western blot實驗以及免疫熒光檢測實驗證實了miR-193b-3p能夠抑制其靶向基因MCL1、MMP19和E2F6的mRNA和蛋白的表達。因此miR-193b-3p可能通過調節(jié)MCL1、MMP19和E2F6的表達在腎透明細胞癌中發(fā)揮抑制腎癌細胞增殖和轉移的能力。研究結論:1、與癌旁腫瘤組織比較,miR-193b-3p在腎透明細胞癌腫瘤組織中顯著下調表達,并在原發(fā)轉移的腎透明細胞腫瘤組織中進一步下調表達。結合腎透明細胞癌患者的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)miR-193b-3p具備作為判斷腎透明細胞癌患者預后生物標記物的潛質。2、miR-193b-3p能夠顯著地抑制腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,在腎透明細胞癌的疾病進程中起著關鍵的抑癌作用。3、在腎透明細胞癌中,miR-193b-3p能夠靶向結合MCL1、MMP19和E2F6的3'UTR區(qū),負性調控其靶向基因的表達發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.11

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本文編號：1735311