本文選題：布比卡因　切入點：卵巢癌細胞　出處：《華中科技大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分布比卡因?qū)δ[瘤細胞活性及耐藥性的影響 目的：明確布比卡因是否有抑制腫瘤細胞活性的作用,并觀察布比卡因處理后是否能增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。驗證布比卡因的促腫瘤細胞凋亡作用是否通過調(diào)控凋亡蛋白酶的活性。 方法：體外培養(yǎng)人卵巢癌細胞(SKOV-3)、前列腺癌細胞(PC-3)和正常腎小管上皮細胞(HK-2),實驗前將腫瘤細胞種植在24孔細胞培養(yǎng)板中,24小時后細胞達到70%-80%融合度時開始試驗。實驗組腫瘤細胞培養(yǎng)基中加入不同容積布比卡因以達到1μM、10μM、100μM、1mM四種不同的終濃度,對照組加入相等容積的生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng)24h或72小時后用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)比色法檢測腫瘤細胞的活性。為比較布比卡因?qū)δ[瘤細胞和正常細胞作用的差異性,將正常的人腎小管上皮細胞(HK-2)與1mM布比卡因共同培養(yǎng)24小時后,用MTT比色法測定細胞的活性。在觀察布比卡因與抗腫瘤藥物共同作用的實驗組中,加入l00μM、1mM布比卡因的同時給予治療濃度的抗腫瘤藥物紫杉醇(taxol),共同培養(yǎng)24小時后同樣以MTT比色法測定腫瘤細胞的活性。凋亡蛋白酶檢測組加入1mM布比卡因,24小時后免疫熒光染色法測定細胞中活性凋亡蛋白酶caspase3、 caspase8和caspase9的表達量。之后使用相應(yīng)蛋白酶抑制劑和FAS配體中和抗體處理,觀察凋亡相關(guān)蛋白酶和細胞膜表明死亡受體在布比卡因誘導的腫瘤細胞凋亡中的作用。 結(jié)果：MTT法檢測細胞活性的結(jié)果顯示,只有最高實驗濃度(1mM)的布比卡因在24和72小時的培養(yǎng)后均顯著抑制了SKOV-3和PC-3腫瘤細胞的活性。100μM組腫瘤細胞活性雖可見輕微下降,但未及顯著性差異。SKOV-3和PC-3腫瘤細胞在1mM布比卡因存在下培養(yǎng)72小時后細胞活性下降的程度明顯大于24小時,表明布比卡因?qū)δ[瘤細胞活性的抑制隨時間的延續(xù)逐步增加。SKOV-3細胞活性下降的程度較PC-3更大,體現(xiàn)局麻藥布比卡因?qū)Σ煌┘毎牟町愋詺饔�。HK-2細胞在1mM布比卡因處理24小時的情況下細胞活性輕微下降,而無顯著性差異,說明了局麻藥有效的殺傷作用更多的體現(xiàn)在腫瘤細胞上,提示我們其可能干擾的是腫瘤細胞特異的生存條件。將100μM、1mM布比卡因與紫杉醇混合培養(yǎng)腫瘤細胞時,表現(xiàn)出的是布比卡因與抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的疊加殺傷效應(yīng),而非協(xié)同效應(yīng)。 免疫熒光分析顯示,1mM布比卡因處理24h后,SKOV-3細胞中活性caspase3,8和9的表達均明顯上升,Caspase8和9抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了SKOV-3的凋亡。PC-3細胞中只有活性caspase3和9的表達上調(diào),而caspase8未見改變,同時只有caspase9抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了布比卡因誘導的腫瘤細胞凋亡,caspase8抑制劑無效。最后,FAS配體中和抗體處理后并未改變布比卡因引起的腫瘤細胞凋亡。 結(jié)論：布比卡因能夠顯著抑制腫瘤細胞活性,且具有劑量和時間依賴性。其誘導腫瘤細胞凋亡的作用與凋亡蛋白酶的激活有關(guān),與細胞膜表明死亡受體無關(guān)。 第二部分布比卡因?qū)δ[瘤細胞增殖與遷移能力的影響 目的：明確布比卡因是否有抑制腫瘤細胞增殖和遷移力的作用。 方法：體外培養(yǎng)卵巢癌(SKOV-3)和前列腺癌(PC-3)細胞,增殖實驗前將腫瘤細胞種植在置有玻片的24孔板上,在24孔板中培養(yǎng)24小時后細胞達到70%-80%融合度時開始試驗。細胞增殖實驗中腫瘤細胞SKOV-3和PC-3的培養(yǎng)基中加入1mM布比卡因后培養(yǎng)24h,之后免疫熒光染色法測定細胞增殖重要標記物ki67蛋白的表達量。腫瘤細胞遷移實驗中使用劃痕實驗。遷移實驗前將腫瘤細胞終于細胞培養(yǎng)皿中,24小時后當其鋪滿皿底形成單細胞層后開始實驗。用一毫升槍頭尖端在皿底做“十”字形劃痕并在皿底座標記,以保證位置固定,顯微鏡下拍照記錄劃痕造成的間隙形態(tài)。之后腫瘤細胞培養(yǎng)液中加入濃度1mM的布比卡因,培養(yǎng)24小時后再次顯微鏡下拍照記錄劃痕形態(tài),用Image-Pro Plus軟件比對前后缺損面積的變化,根據(jù)公式(初始缺損面積-最終缺損面積)/初始缺損面積,計算出創(chuàng)傷愈合率,由此估算細胞整體遷移率。 結(jié)果：熒光強度分析結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中加入1mM布比卡因培養(yǎng)24小時后,SKOV-3和PC-3細胞中Ki67的表達均顯著下降,表明1mM布比卡因有效抑制了這兩種腫瘤細胞的增殖能力。細胞遷移實驗中,SKOV-3和PC-3在1mM布比卡因的影響下,較對照組的創(chuàng)傷愈合率顯著下降,表明其細胞遷移能力因布比卡因的存在而下降。結(jié)論：布比卡因能有效抑制SKOV-3和PC-3腫瘤細胞的增殖能力和遷移率。 第三部分GSK-3β在布比卡因誘導的腫瘤細胞凋亡中的影響 目的：探索GSK-3β的活性對布比卡因誘導的SKOV-3和PC-3腫瘤細胞凋亡有何種影響。 方法：體外培養(yǎng)卵巢癌(SKOV-3)和前列腺癌(PC-3)細胞,實驗前將腫瘤細胞種植玻片上,在24孔板中培養(yǎng)24小時后細胞達到70%-80%融合度時開始試驗。在lmM布比卡因處理24小時后,免疫熒光法測定磷酸化的總GSK-3β、活化型GSK-3β(GSK-3βtyr216)以及抑制型GSK-3β (GSK-3βser9)的量。其它實驗在1mM布比卡因加入培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上,用GSK-3抑制劑SB-216763抑制其活性,觀察腫瘤細胞存活情況。再應(yīng)用基因沉默技術(shù)用siRNA sc-35527沉默GSK-3β基因,在此基礎(chǔ)上加入1mM布比卡因,培養(yǎng)24小時后用免疫熒光技術(shù)觀察凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase3, Caspase8, Caspase9的表達情況,以及最終腫瘤細胞的生存情況。 結(jié)果：實驗結(jié)果顯示1mM布比卡因作用24小時后,SKOV-3磷酸化的總GSK-3β、GSK-3βryr216和GSK-3βser9均有顯著增加,其中代表GSK-3β活性的磷酸化GSK-3β tyr216升高最為明顯,有將近一倍的提升。而PC-3中磷酸化的總GSK-3β、 GSK-3βtyr216和GSK-3βser9均無顯著改變。抑制劑和SiRNA的運用都部分減輕了布比卡因誘導的SKOV-3細胞凋亡,但這些作用并未在PC-3細胞上發(fā)現(xiàn)。在沉默GSK-3ββ基因后,我們發(fā)現(xiàn)GSK-3β僅有微弱表達,免疫熒光分析顯示,凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase3, Caspase8,Caspase9的表達隨著GSK-3β基因的沉默也顯著下降。 結(jié)論：1mM布比卡因的處理增加了SKOV-3磷酸化的總GSK-3β、 GSK-3β tyr216和GSK-3β ser9,其中活化型GSK-3β升高最為顯著。但是對PC-3無影響。GSK-3β活性的存在是布比卡因誘導SKOV-3腫瘤細胞凋亡的必要條件,而其對布比卡因誘導的PC-3腫瘤細胞的凋亡無顯著影響。
[Abstract]:Part 1 Effect of bupivacaine on the activity of tumor cells and drug resistance
Objective: to determine whether bupivacaine inhibit tumor cell activity, and observe whether bupivacaine after treatment can increase the sensitivity of tumor cells to anticancer agents. Promote tumor cell apoptosis by regulating the apoptosis of bupivacaine is verified protease activity.
Methods: human ovarian cancer cells in vitro (SKOV-3), prostate cancer cells (PC-3) and normal renal tubular epithelial cells (HK-2), before the experiment to tumor cells grown in 24 well cell culture plate, began to test 24 hours after cells reached 70%-80% fusion degree. Adding different volume of bupivacaine medium to reach 1 mu the experimental group M of tumor cell culture, 10 M, 100 M, 1mM four different final concentration, the control group normal saline with the same volume, cultured for 72 hours with MTT or 24h (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) than tumor cell assay activity. The difference of bupivacaine on tumor the role of cells and normal cells, normal human renal tubular epithelial cells (HK-2) and 1mM bupivacaine co cultured for 24 hours, the activity of cells was measured by MTT colorimetry. In the observation of antitumor drug and total bupivacaine The experimental group with the effect of adding l00, M, 1mM and bupivacaine anticancer drug paclitaxel in the treatment of concentration (Taxol), co culture activity also using the MTT colorimetric assay of tumor cells after 24 hours. 1mM bupivacaine join apoptosis protease testing group, 24 hours after immunofluorescence staining was used to determine the activity of apoptosis protease Caspase3 cells, expression of caspase8 and caspase9. After using the corresponding protease inhibitors and FAS ligand neutralizing antibody treatment, observation of apoptotic proteases and cell membrane showed that the role of death receptor in tumor cell apoptosis induced by bupivacaine.
Results: MTT cells viability assay results showed that only the highest concentration (1mM) of bupivacaine after cultured 24 and 72 hours after significantly inhibited the activity of.100 M group, the activity of tumor cells SKOV-3 and PC-3 tumor cells showed a slight decline, but no significant difference between.SKOV-3 and PC-3 tumor cells in 1mM bupivacaine the presence of decreased cell activity after cultured for 72 hours was significantly greater than 24 hours, and that the continuation of bupivacaine on the activity of tumor cells inhibition with time gradually decreased with the increase of.SKOV-3 cell activity degree is more serious than PC-3, reflect the local anesthetics bupivacaine on different cancer cell killing effect of.HK-2 cells in 1mM cells treated with bupivacaine activity for 24 hours under the condition of slight decrease, but no significant difference, that local anesthetic effective killing effect is more reflected in the tumor cells, suggesting that I have The possible interference is a tumor specific survival condition. 100 M, 1mM bupivacaine and paclitaxel mixed culture of tumor cells, showing the killing effect of bupivacaine is superimposed with anti tumor drugs on tumor cells, and a synergistic effect.
Immunofluorescence analysis showed that 1mM of bupivacaine after 24h treatment, the activity of caspase3,8 in SKOV-3 cells and 9 expression were significantly increased, and Caspase8 9 inhibitors partially reversed the SKOV-3 apoptosis in.PC-3 cells only active Caspase3 and 9 expression, while caspase8 was not changed, with only caspase9 inhibitor partially reversed the apoptosis of tumor cells induced by bupivacaine the caspase8 inhibitor is invalid. Finally, did not change the apoptosis of tumor cells induced by bupivacaine neutralizing antibody FAS ligand.
Conclusion: bupivacaine can significantly inhibit the activity of tumor cells, and has a dose and time dependent manner. The apoptosis of tumor cells and apoptosis protease activation, and cell membrane showed that death receptor independent.
The second part of bupivacaine on tumor cell proliferation and migration
Objective: to determine whether bupivacaine inhibit the proliferation and migration of tumor cells.
Methods: in vitro cultured ovarian cancer (SKOV-3) and prostate cancer (PC-3) cells, the proliferation of tumor cells before the experiment will be planted in the 24 hole plate glass on the train began to test 24 hours after cells reached 70%-80% fusion degree in 24 well plates. 24h culture medium added 1mM bupivacaine SKOV-3 tumor cells and PC-3 cells in the experiment of proliferation after expression after immunofluorescence staining was used to determine the cell proliferation important marker Ki67 protein. The migration of tumor cells using scratch test in the experiment. Before the experiment the migration of tumor cells and finally cell culture dish, after 24 hours when the covered dish bottom form a single cell layer after the start of a test. Ml gun head tip in the dish bottom "ten" shape and on the base plate scratch marks, in order to ensure the fixed location, space form under the microscope photograph scratches caused. After adding concentration of 1mM of tumor cell culture solution Bupivacaine, training again after 24 hours under the microscope and photographed by Image-Pro Plus scratch morphology, software defect area ratio before and after the change, according to the formula (initial defect area - Final defect area) / initial defect area, calculate the wound healing rate, which estimates the overall cell migration rate.
Results: the fluorescence intensity showed that cultured 24 hours after adding 1mM bupivacaine medium, the expression of Ki67 and SKOV-3 in PC-3 cells were significantly decreased, 1mM showed that the two bupivacaine can effectively inhibit the proliferation of tumor cells. The ability of cell migration experiment, SKOV-3 and PC-3 in 1mM bupivacaine, compared with the control group the wound healing rate was significantly decreased, showed that the cell migration ability because of the existence of bupivacaine decreased. Conclusion: the proliferation and migration of bupivacaine can effectively inhibit SKOV-3 and PC-3 tumor cells.
The third part of GSK-3 beta in tumor cell apoptosis induced by bupivacaine
Objective: To explore the GSK-3 beta activity has any impact on SKOV-3 and PC-3 bupivacaine induced apoptosis of tumor cells.
Methods: in vitro cultured ovarian cancer (SKOV-3) and prostate cancer (PC-3) cells, before the experiment to tumor cell seeding slides, culture began to test 24 hours after cells reached 70%-80% fusion degree in 24 well plate. The lmM of bupivacaine after 24 hours of treatment, the total determination of phosphorylation of GSK-3 beta immunofluorescence, activation GSK-3 beta (GSK-3 beta tyr216) and inhibition of GSK-3 beta (GSK-3 beta ser9). The amount of other experiments in 1mM bupivacaine culture medium was added on the basis of inhibiting the activity of GSK-3 inhibitor SB-216763, tumor cell survival. Using gene silencing technology with siRNA sc-35527 silencing GSK-3 gene, on the basis of joining the 1mM bupivacaine, after 24 hours of incubation with immunofluorescence technique to observe the apoptosis protease Caspase3, Caspase8, Caspase9 expression, and the final survival of tumor cells.
Results: the results showed that 1mM of bupivacaine after 24 hours, the total SKOV-3 phosphorylation of GSK-3 beta, GSK-3 beta ryr216 and GSK-3 beta ser9 increased significantly, the phosphorylation of GSK-3 beta tyr216 GSK-3 beta activity increased most obviously, there are nearly one fold increase in PC-3 phosphorylation. The total GSK-3 beta. There were no significant changes in GSK-3 tyr216 and GSK-3 ser9 beta beta. The use of inhibitors and SiRNA are partially alleviate the apoptosis of SKOV-3 cells induced by bupivacaine, but these effects are not found in PC-3 cells. The silencing of GSK-3 beta gene, we found only weak expression of GSK-3 beta, immunofluorescence analysis showed that apoptosis related protein Caspase3 the expression of Caspase9, Caspase8, GSK-3 with beta gene silencing also decreased significantly.
Conclusion: 1mM bupivacaine increased phosphorylation of SKOV-3 GSK-3 beta, GSK-3 beta tyr216 and GSK-3 beta ser9, the activation of GSK-3 beta increased most significantly. But no influence on PC-3.GSK-3 beta activity is a necessary condition for bupivacaine induced SKOV-3 cell apoptosis, and the PC-3 of tumor cells induced by bupivacaine apoptosis has no significant effect.

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614;R737.31;R737.25

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