本文選題：miRNA　切入點(diǎn)：miR-195　出處：《武漢大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的：前列腺癌(prostate cancer,PCa)在歐美地區(qū)等發(fā)達(dá)國家是最常見的惡性腫瘤,在男性惡性腫瘤中死亡率較高,死亡率僅次于支氣管肺癌。雖然前列腺癌在早期診斷和治療方法上有了很大的進(jìn)展,由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,部分前列腺癌患者的療效仍不令人滿意。前列腺癌在初始治療時大多為激素依賴性腫瘤,內(nèi)分泌治療后易轉(zhuǎn)變?yōu)榧に胤且蕾囆�。難治性前列腺癌患者最終隨著疾病的進(jìn)展而死亡。前列腺癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移牽涉到多種信號通路和不同的分子機(jī)制。常由多種原癌基因和抑癌基因參與,是一個非常復(fù)雜的過程。所以尋找前列腺腫瘤早期診斷的標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)成為泌尿外科研究的重要課題。近年來大量的研究證明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用,miRNA家族在轉(zhuǎn)錄后水平有極強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。越來越多的科學(xué)家參與到miRNA的研究中。超過50%的已知miRNA通過直接調(diào)控分子靶點(diǎn)參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。到目前為止,與前列腺癌疾病相關(guān)的大部分miRNA還不清楚。已有研究表明miR-195在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在不同的腫瘤組織中,miR-195的表達(dá)方式具有差異性。進(jìn)一步研究表明miR-195在多種腫瘤中具有抗腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用。miR-195通過作多種腫瘤治療的分子靶點(diǎn),參與腫瘤的生長、增殖、凋亡、侵襲與遷移的調(diào)節(jié)。以上研究結(jié)果表明miR-195在腫瘤的臨床診斷、治療、預(yù)后有著巨大的應(yīng)用前景,還可以應(yīng)用到改善腫瘤的耐藥性。到目前為止miR-195在前列腺癌中的表達(dá)調(diào)控情況和與前列腺癌的相關(guān)性尚未進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)將在前列腺癌中進(jìn)行miR-195的相關(guān)研究,了解miR-195在前列腺癌中的表達(dá)與功能以及調(diào)控機(jī)制。前列腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制隨著新的miRNA的發(fā)現(xiàn)有了進(jìn)一步的認(rèn)識,可能為臨床分子靶向治療提供新的作用靶點(diǎn)。方法：將采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對不同前列腺癌組織中miR-195的mRNA表達(dá)情況及與前列腺癌臨床關(guān)系進(jìn)行分析研究。完整收集患者年齡、術(shù)前血清PSA、前列腺癌臨床分期,記錄患者術(shù)后前列腺癌Gleason評分。對切緣情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、精囊浸潤、血管浸潤、神經(jīng)周圍浸潤的情況做完整記錄。術(shù)后定期隨訪記錄PSA生化復(fù)發(fā)情況。將miR-195在前列腺癌中的表達(dá)情況用統(tǒng)計學(xué)方法與各個臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。我們將miR-195表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入前列腺癌細(xì)胞系(PC-3和LNCaP)中,研究miR-195對前列腺癌細(xì)胞的調(diào)控作用。對不同處理組前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)方法、transwell遷移實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。從而檢測miR-195對前列腺癌細(xì)胞的增殖能力、前列腺癌細(xì)胞遷移能力和前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。通過上調(diào)細(xì)胞中miR-195的表達(dá),觀察miR-195對前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的功能影響。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件推測BCOX1為miR-195的靶基因。利用microarray數(shù)據(jù)庫中大量已知檢測結(jié)果,應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法將不同前列腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)和BCOX1表達(dá)水平進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)BCOX1的表達(dá)水平與前列腺癌患者參數(shù)有一定相關(guān)性,可能為前列腺癌腫瘤相關(guān)基因。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)確定miR-195與BCOX1之間的直接調(diào)控關(guān)系。在上調(diào)miR-195表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞中利用qRT-PCR和western blot檢測BCOX1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變；在前列腺癌組織中分析BCOX1的mRNA表達(dá)水平和miR-195之間的關(guān)系,從而進(jìn)一步檢驗(yàn)miR-195可以負(fù)向調(diào)控BCOX1的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中研究miR-195通過負(fù)向調(diào)控BCOX1對前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)影響。在PC-3和LNCaP前列癌細(xì)胞中分別構(gòu)建四組細(xì)胞：miR-195高表達(dá)組,shRNA抑制BCOX1組,miR-195+BCOXl共表達(dá)組合和對照組來研究前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。從而研究miR-195在前列腺癌細(xì)胞中的調(diào)控作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,利用PC-3和LNCaP前列癌細(xì)胞中分別構(gòu)建的三組細(xì)胞：miR-195高表達(dá)組,miR-195+BCOX1共表達(dá)組合和對照組在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)。記錄不同組前列腺癌細(xì)胞移植瘤生長情況,研究miRNA-195和BCOX1在裸鼠移植瘤內(nèi)表達(dá)水平變化。進(jìn)一步評估m(xù)iRNA-195基因?qū)β闶笄傲邢侔┮浦擦錾L曲線的影響,最后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平上證實(shí)miRNA-195能夠通過沉默BCOX1的表達(dá)抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤生長和轉(zhuǎn)移。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明miR-195在前列腺癌組織中低表達(dá)。miR-195與血PSA、Gleason評分、臨床分期和精囊侵犯密切相關(guān)。miR-195對于前列腺癌患者PSA生化復(fù)發(fā)和患者的總生存具有有效的預(yù)測參考作用。成功的建立了高表達(dá)miR-195的PC-3和LNCaP細(xì)胞系。上調(diào)細(xì)胞中miR-195的表達(dá),可以降低前列腺細(xì)胞的克隆形成能力和遷移與侵襲能力。通過miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測軟件推測miR-195可作用于BCOX1的3'UTR。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步確定miR-195與BCOX1之間的直接調(diào)控關(guān)系。miRNA-195可以通過沉默BCOX1基因的表達(dá),來調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平驗(yàn)證miR-195對PC-3和LNCaP細(xì)胞的抑瘤作用。結(jié)論：miR-195在前列腺癌細(xì)胞中可以通過直接特異性結(jié)合于BCOX1的3'UTR區(qū),負(fù)向調(diào)控BCOX1的表達(dá)。miR-195在體外實(shí)驗(yàn)中通過沉默BCOX1抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。miR-195在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過沉默BCOX1對移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移起到了非常有效的抑制作用。對miR-195及其作用靶點(diǎn)BCOX1的研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識前列腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的分子機(jī)制,為臨床分子靶向治療的研究提供了新的作用靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25

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本文編號：1721894