發(fā)布時間：2018-04-03 08:39

  本文選題：腎透明細胞癌　切入點：mTOR　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一部分 自噬聯(lián)合mTOR通路雙重抑制對腎癌細胞的作用及其機制目的：探索腎癌細胞自噬水平以及mTOR活性,研究雙重抑制對腎癌細胞生長的作用以及相關(guān)機制。方法：RCC4、ACHN、860、769P人腎癌細胞株及HK2人正常腎小管上皮細胞株均購自美國ATCC細胞庫。利用Western blotting檢測腎癌細胞以及正常對照細胞的基本自噬水平以及mTOR信號通路蛋白表達的變化。對比單獨應(yīng)用mTOR或自噬抑制劑,以及聯(lián)合抑制三種治療對腎癌細胞內(nèi)mTOR及自噬通路的影響。同時,通過結(jié)晶紫試驗研究mTOR及自噬的雙重抑制對腎癌細胞增殖的影響,并通過研究細胞凋亡相關(guān)基因的表達,探討自噬及mTOR雙重抑制對腎癌細胞凋亡的影響。結(jié)果：相對于正常腎小管上皮HK2細胞,mTOR活性在4種腎癌細胞中均明顯升高,786O、769P細胞基礎(chǔ)自噬水平較HK2輕度升高,而RCC4、ACHN細胞不僅基礎(chǔ)自噬水平較正常對照升高明顯,其mTOR通路亦過度激活,對此類腎癌細胞進行mTOR抑制后,自噬水平進一步升高并不明顯。這提示這些腎癌細胞中的自噬過程可能己不完全依賴mTOR調(diào)控。雷帕霉素在體外可以明顯抑制7860和RCC4細胞的增殖,而使用shRNA、氯喹等方法抑制自噬僅對7860細胞增殖起協(xié)同抑制作用。通過mTOR和自噬的雙重抑制引起了7860腎癌細胞凋亡,但并未引起RCC4細胞凋亡,其可能在RCC4細胞中引起壞死性凋亡(Necroptosis)。結(jié)論：腎癌細胞中均存在不同程度的mTOR活性增高和自噬水平增高,部分腎癌細胞同時具有高基礎(chǔ)自噬水平和mTOR過度激活的特點。單獨應(yīng)用自噬或mTOR抑制劑對腎癌細胞株具有不同程度的抑制作用,而聯(lián)合應(yīng)用雙重阻滯對具有高]mTOR、高自噬水平腎癌細胞(RCC4)的抑制效果明顯低于自噬水平較低的腎癌細胞(7860)。雙重抑制引起7860細胞凋亡,而可能引起RCC4細胞產(chǎn)生壞死性凋亡。第二部分 自噬聯(lián)合磷酸戊糖途徑雙重抑制對腎癌細胞的作用及其機制目的：探索以RCC4為代表的具有高mTOR、高自噬水平腎癌細胞在抑制自噬后代謝通路的變化,并研究針對該代謝通路以及自噬雙重抑制后對此類腎癌細胞的治療作用。方法：為探索RCC4腎癌細胞在自噬抑制劑作用下代謝通路的改變,我們對氯喹和對照劑(DMSO)處理后的RCC4細胞進行了代謝譜分析。通過對結(jié)果進行代謝組富集分析(Metabolite Set Enrichment Analysis, MSEA),擬發(fā)現(xiàn)治療組與對照組見差異最大的代謝通路改變,并通過給予RCC4細胞相應(yīng)的抑制劑后檢測細胞,研究氯喹與糖代謝抑制劑是否對RCC4細胞增殖具有協(xié)同抑制作用。因腫瘤中自噬及代謝通路的改變與氧化應(yīng)激關(guān)系密切,我們通過檢測細胞的氧消耗和營養(yǎng)物消耗評價RCC4細胞在自噬被抑制后代謝的改變。同時,通過對pNFxB的分析進一步了解自噬與代謝雙重抑制對RCC4細胞產(chǎn)生抑制的可能機制。結(jié)果：RCC4腎癌細胞在應(yīng)用氯喹前后代謝通路具有明顯變化,其中磷酸戊糖途徑(PPP)的變化最為明顯。PPP途徑活性在RCC4細胞自噬被抑制后明顯升高,而其代謝產(chǎn)物的含量也顯著增多。應(yīng)用PPP途徑抑制劑6-氨基煙酰胺(6AN)后,RCC4細胞的增殖受抑制,而氯喹顯著增加了RCC4細胞對6AN治療的敏感性。氯喹與6AN對RCC4細胞具有協(xié)同性抑制作用。RCC4細胞的自噬被抑制后,其對葡萄糖的攝取明顯增多,而乳酸升高不明顯,提示糖酵解并不是其糖代謝改變的主要途徑,同時,PPP途徑代謝產(chǎn)物在氯喹實驗組顯著更高。通過對pNF(?)B的分析,我們發(fā)現(xiàn)氯喹和6AN均使RCC4細胞中pNF(?)B增加,可能通過炎性體(Inflammasome)途徑抑制RCC4細胞增殖。結(jié)論：RCC4腎癌細胞具有高mTOR、高自噬水平的特點,其對氯喹聯(lián)合雷帕霉素治療敏感性較低。通過對氯喹處理前后RCC4細胞的代謝譜分析發(fā)現(xiàn),PPP途徑增高可能是其產(chǎn)生抵抗的機制。聯(lián)合應(yīng)用氯喹和PPP抑制劑6-AN可對RCC4細胞產(chǎn)生協(xié)同抑制作用,同時,氯喹和6 AN均使細胞內(nèi)NFxB水平增高,提示氯喹聯(lián)合6AN對RCC4細胞增殖的抑制作用可能通過炎性體介導(dǎo)。第三部分 腎透明細胞癌中自噬、PPP途徑相關(guān)基因表達和疾病預(yù)后的關(guān)系目的：探索腎透明細胞癌中自噬通路及磷酸戊糖途徑(PPP)途徑中重要基因的表達情況、與VEGF的關(guān)系以及與患者預(yù)后的關(guān)系。方法：我們采用in silico方法通過生物信息學(xué)手段提取并分析The Cancer Genome Atlas (TCGA)腎透明細胞癌數(shù)據(jù)庫中所有完成了RNA-seq深度測序的基因表達數(shù)據(jù)。利用源自Memorial Sloan-Kettering癌癥中心(MSKCC)開發(fā)的cBioPortal for Cancer Genomics在線TCGA分析軟件進行分析。首先我們選取了腎透明細胞癌Provisional數(shù)據(jù)庫中完成了RNA-seq深度測序的病例,隨后我們選取了自噬通路中關(guān)鍵的8個基因(ULK1、ATG5、BECN1、ATG7、ATG12、 ATG13、MAP1LC3B、MAP1LC3C),以及PPP途徑中關(guān)鍵的7個基因(G6PD、 PGLS、PGD、RPIA、RPE、TALDO1、 TKT),利用cBioPortal軟件分析這些基因的表達在腎癌組織和癌旁正常腎組織中是否存在顯著差異、對表達存在差異的基因分析其與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系、交互分析自噬和PPP途徑關(guān)鍵基因之間的相互關(guān)系。結(jié)果：我們采用cBioPortal分析平臺分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中完成RNA-seq的469名腎透明細胞癌患者的臨床病理資料。自噬相關(guān)基因ULK1、ATG7、MAP1LC3C表達改變的患者預(yù)后顯著差于對照,而ATG5、BECN1、ATG12、ATG13、 MAP1LC3B表達與預(yù)后無顯著相關(guān)性。包含上述基因的自噬相關(guān)基因集合的表達改變與患者預(yù)后顯著相關(guān)。PPP相關(guān)基因G6PD、PGLS、GD、RPIA、TALDO1、TKT的表達改變的患者預(yù)后顯著差于對照,而RPE表達與預(yù)后無顯著相關(guān)性。包含上述基因的PPP相關(guān)基因集合的表達改變與患者預(yù)后顯著相關(guān)。自噬與PPP相關(guān)基因間存在廣泛聯(lián)系。結(jié)論：自噬與PPP通路相關(guān)基因的表達改變與腎透明細胞癌患者的預(yù)后關(guān)系密切。自噬與PPP通路相關(guān)基因之間表達存在廣泛的聯(lián)系和相關(guān)性,提示自噬和PPP途徑在腎透明細胞癌中可能起重要作用。
[Abstract]:The effects of autophagy and autophagy on the proliferation of renal cancer cells were investigated . The expression of pNF ( ? ) B in RCC4 cells was inhibited by means of bioinformatic analysis . The results showed that the expression of pNF ( ? ) B in RCC4 cells was significantly higher than that of RCC4 cells . Conclusion : The expression of autophagy - related genes related to PPP - related genes is closely related to the prognosis of patients with renal clear cell carcinoma . Conclusion : There is a wide association between autophagy and the prognosis of patients with renal clear cell carcinoma . Conclusion : There is a wide association and correlation between autophagy and PPP - related genes . It is suggested that autophagy and PPP pathway may play an important role in renal clear cell carcinoma .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

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本文編號：1704449