本文選題：DNA氧化　切入點(diǎn)：2型糖尿病　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是以血液中葡萄糖水平升高為主要特點(diǎn)的一種終生進(jìn)行性代謝疾病,糖尿病患者中近95%是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者,持續(xù)的高血糖不斷地攻擊全身各個(gè)微血管和大血管,導(dǎo)致了各種并發(fā)癥的出現(xiàn)。而糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是其中最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)約有5%～10%的2型糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展為DN,雖然比例不高,但是2型糖尿病患者數(shù)目龐大。DN起病十分隱匿,隨著病程的延長(zhǎng)和病變的逐漸深入,最終發(fā)展為終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD),患者只能依靠血液透析等替代治療方式來(lái)維持生命。DN已經(jīng)成為糖尿病病人死亡的重要原因之一。因此,研究DN的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的預(yù)防和治療措施,具有重大的研究意義。二十二碳六烯酸(Docosahaexaenoic acid, DHA),屬于n-3系多不飽和脂肪酸,含有6個(gè)碳碳雙鍵,不飽和度很高,在體內(nèi)極易被其他氧化物質(zhì)氧化而生成一系列的次級(jí)代謝產(chǎn)物。大量研究證明DHA及其代謝衍生物具有抗氧化應(yīng)激,抗炎,參與細(xì)胞膜構(gòu)成,增加細(xì)胞膜流動(dòng)性,調(diào)節(jié)離子通道和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等多種重要的生物學(xué)功能。目前,對(duì)于DN的具體發(fā)病機(jī)制,還不是很明確。T2DM和DN患者機(jī)體DNA的氧化水平如何?DNA的氧化損傷在T2DM腎損傷中的作用如何?飲食中添加DHA會(huì)對(duì)T2DM腎臟中DNA的氧化水平有何影響?能否有效地緩解T2DM所引起的腎組織損傷?DHA又是通過何種分子機(jī)制對(duì)T2DM腎臟DNA的氧化損傷造成影響的呢?為了解決上述問題,本研究進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：第一,建立了測(cè)定尿液中8-OHdG的生化分析新方法,并應(yīng)用該方法分析檢測(cè)了CON組、T2DM組和DN組的DNA氧化損傷水平。第二,通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)考察了DHA對(duì)T2DM大鼠腎臟DNA氧化損傷的影響。為臨床應(yīng)用DHA輔助防治DN提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。第一部分DNA氧化損傷生物標(biāo)記物8-OHdG毛細(xì)管電泳分析新方法的建立目的：為下一步研究T2DM和DN患者機(jī)體的DNA氧化水平奠定方法學(xué)的基礎(chǔ)。方法：固相萃取結(jié)合膠束毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)法。結(jié)果：本研究建立了一種固相萃取結(jié)合膠束毛細(xì)管電泳檢測(cè)尿液中8-OHdG的新方法。通過優(yōu)化SPE萃取條件和MEKC分離條件,在最佳條件下,8-OHdG濃度在1到500μg L-1之間線性良好,LOD(S/N=3)為0.27 g L-1,LOQ(S/N=10)為0.82μg L-1。該方法檢測(cè)尿液中8-OHdG的日間精密度和日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.6%和4.3%,(健康兒童尿液加標(biāo))回收率在99.8%-103.2%之間。該方法彌補(bǔ)了CE-UV在測(cè)定痕量組分方面的不足。小結(jié)：建立了一種簡(jiǎn)單,靈敏,快速的檢測(cè)尿液中8-OHdG的新方法,為機(jī)體DNA氧化損傷水平的測(cè)量提供了一種新的途徑。第二部分DNA氧化水平與2型糖尿病腎損傷之間相關(guān)性的研究目的：探討2型糖尿病患者腎損傷與DNA氧化的關(guān)系。方法：1應(yīng)用第一部分新建的以及本室原有的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法測(cè)定并分析CON組、T2DM組和DN組尿液中的8-OHdG和creatinin；2對(duì)尿液中8-OHdG/creatinine比值與其他臨床生化指標(biāo)之間進(jìn)行person相關(guān)性分析。結(jié)果：DN組患者尿液中8-OHdG/creatinine(45.14±12.68 μg/g)顯著高于CON組(11.72±2.38μg/g)和T2DM組(16.37±4.97μg/g),尿液中8-OHdG/creatinine的水平與尿酸(UA)值無(wú)顯著相關(guān)性,與糖化血紅蛋白和24小時(shí)尿蛋白排泄量之間有顯著正相關(guān)性。小結(jié)：DN組患者腎損傷與DNA的氧化有關(guān)第三部分DHA通過降低DNA氧化水平緩解2型糖尿病大鼠的腎損傷目的：探討DHA是否可通過降低氧化應(yīng)激及DNA的氧化來(lái)改善T2DM的腎損傷。方法：1高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)T2DM大鼠,并經(jīng)飲食補(bǔ)充DHA；2利用生物化學(xué)和病理學(xué)方法檢測(cè)大鼠腎臟功能相關(guān)的生化指標(biāo)和腎組織結(jié)構(gòu),評(píng)價(jià)DHA對(duì)腎臟功能的影響；3利用組織熒光和生物化學(xué)方法,測(cè)定大鼠腎臟組織的ROS水平、脂質(zhì)過氧化水平、DNA的氧化損傷,確定DHA能否改善T2DM腎臟組織的氧化應(yīng)激,脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷；4使用生物化學(xué)的方法檢測(cè)大鼠腎臟組織的重要抗氧酶活性和重要的抗氧物質(zhì)的含量,確定DHA對(duì)T2DM大鼠腎臟組織的抗氧化系統(tǒng)的影響；5采用Real time PCR檢測(cè)飲食添加DHA對(duì)T2DM大鼠腎臟三大抗氧化系統(tǒng)主要相關(guān)抗氧酶nRNA表達(dá)水平的影響；6Western blot檢測(cè)飲食添加DHA對(duì)T2DM大鼠腎臟組織中NADPH氧化酶重要亞基的蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果：1 DHA降低了T2DM大鼠24小時(shí)尿蛋白的排泄率32周干預(yù)結(jié)束時(shí),DM組大鼠的24小時(shí)尿蛋白排泄率(1893.9±948.8ng)顯著高于對(duì)照組(477.5±197.1 ng)(P0.05)；而DHA組大鼠的24小時(shí)尿蛋白排泄率(1133.9±542.7 ng)明顯低于DM組(P0.05),但顯著高于CON組(P0.05)。2 DHA改善了T2DM大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的損傷HE染色結(jié)果顯示：CON組大鼠腎臟未見明顯的腎組織病理學(xué)變化,腎小球邊緣齊整,結(jié)構(gòu)正常,分布較均勻,細(xì)胞核排列較為整齊,腎小管形態(tài)清晰。DM組大鼠腎小球分布不均勻,細(xì)胞核排布散亂,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫,基質(zhì)彌漫性增多,腎小球體積增大,平均腎小球截面積明顯高于CON組。DHA組介于以上兩者之間,較DM組有所改善。3 DHA改善了T2DM大鼠腎臟組織的DNA損傷3.1 DHA降低了T2DM大鼠腎小管內(nèi)8-OHdG的含量腎臟組織石蠟切片免疫熒光結(jié)果顯示在腎小管內(nèi)8-OHdG的含量DM組明顯高于CON組和DHA組。說明飲食中添加DHA可有效減少T2DM大鼠腎臟腎小管內(nèi)8-OHdG的生成。3.2 DHA緩解了T2DM大鼠腎臟組織核DNA的凋亡DM組腎臟組織切片TUNEL染色顯示凋亡的強(qiáng)度明顯高于CON組和DHA組,說明飲食中添加DHA可有效緩解T2DM大鼠腎臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡4 DHA降低了2型糖尿病大鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激水平4.1 DHA降低了2型糖尿病大鼠腎臟組織的ROS水平DHE染色法和熒光分光光度檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果一致顯示：DM組大鼠腎臟組織中的ROS水平顯著高于CON組(P0.05)；而DHA組大鼠腎臟組織中的ROS水平明顯低于DM組(P0.05),而與CON組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.2 DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織中TADPH氧化酶重要亞基在nRNA水平及蛋白水平上的表達(dá)在高血糖條件下TADPH氧化酶可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS。Real time PCR結(jié)果顯示DHA可通過下調(diào)NADPH氧化酶的Nox2, Nox4口P22 phox亞基基因在1nRNA水平上的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)糖尿病大鼠腎臟組織的抗氧化能力。Western Blot結(jié)果顯示DHA可通過下調(diào)NADPH氧化酶的Nox2, Nox4, P22 phox和p-P47 phox亞基基因的蛋白表達(dá)水平來(lái)降低糖尿病大鼠腎臟組織的ROS水平。5DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織脂質(zhì)過氧化物的含量5.1 DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織脂質(zhì)過氧化物MDA的含量MD A是膜脂質(zhì)過氧化的重要的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生能加劇細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷程度。DM組腎臟組織勻漿液中MDA的含量為(1.20±0.18nmol/mg prot)明顯高于CON組(0.86±0.13 nmol/mg prot)和DHA組(1.01±0.19 nmol/mg prot),說明飲食中添加DHA可有效減少T2DM大鼠腎臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA的生成。5.2 DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織腎小管內(nèi)4-HNE含量在體內(nèi)4-HNE是n-6系多不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物,大鼠腎小管內(nèi)4-HNE的含量DM組顯著高于CON組和DHA組；而腎小球內(nèi)4-HNE的含量,DM組和DHA組均顯著高于CON組,但DM組和DHA組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明飲食中添加DHA能夠有效抑制T2DM大鼠腎小管內(nèi)的n-6系脂肪酸的過氧化。6 DHA提高了T2DM大鼠腎臟組織的抗氧能力6.1 DHA提高了T2DM大鼠腎臟組織的總抗氧能力(T-AOC)DM組腎臟組織勻漿液中T-AOC(1.03±0.23 U/mg prot)明顯低于CON組(1.39±0.41 U/mg prot)和DHA組(1.31±0.28 U/mg prot),說明飲食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠腎臟的總抗氧能力。6.2 DHA提高了T2DM大鼠腎臟組織內(nèi)谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶和硫氧還蛋白還原酶等抗氧酶的活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了三組大鼠腎臟組織勻漿液中谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶、總超氧化物歧化酶和硫氧還蛋白還原酶等重要的抗氧酶的酶活性,結(jié)果顯示飲食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠腎臟內(nèi)谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶和硫氧還蛋白還原酶的活性。6.3 DHA增加了T2DM大鼠腎臟組織內(nèi)谷胱甘肽的含量結(jié)果顯示,DM組腎臟組織勻漿液中GSH的含量(0.0062±0.0035μM/g Tissue)明顯低于CON組(0.0213±0.0049μM/g Tissue)和DHA組 (0.0112±0.0037μM/g Tissue),說明飲食中添加DHA可以有效增加T2DM大鼠腎臟內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量。6.4 DHA增加了T2DM大鼠腎臟組織內(nèi)4-HHE的含量4-HHE是n-3系多不飽和脂肪酸(主要是DHA)過氧化的產(chǎn)物,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4-HHE在腎小球和腎小管內(nèi)的含量變化趨勢(shì)一致,DHA組的4-HHE含量顯著高于DM組和CON組。這說明DHA可以作為抗氧劑通過自身氧化來(lái)降低腎臟組織的氧化損傷。7 DHA可以上調(diào) SOD1、Gpx1和Gpx4-1等基因在1nRNA水平上的表達(dá)。小結(jié)：1 DHA改善了T2DM大鼠的腎功能和腎組織損傷。2 DHA通過增加抗氧酶的活性以及自身氧化從而降低了T2DM大鼠腎組織DNA的氧化損傷和氧化應(yīng)激水平。結(jié)論：1 T2DM的腎損傷與腎臟組織內(nèi)DNA的氧化損傷相關(guān)。2 DHA通過增加抗氧酶的活性以及通過自身氧化降低了T2DM大鼠腎組織的氧化應(yīng)激水平和DNA的氧化損傷改善了腎功能和腎組織損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：1704290