本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：一、研究背景 前列腺癌是常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一。美國(guó)2012年前列腺癌新發(fā)病例241740例，其發(fā)病率為男性癌癥之首，死亡率為癌癥疾病第二位。在我國(guó)，由于人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)改變以及診斷技術(shù)的提高，前列腺癌的發(fā)病率及死亡率均呈逐漸升高的趨勢(shì)。雖然前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有美國(guó)及歐洲國(guó)家高，但我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，且大部分前列腺癌患者就診時(shí)已失去手術(shù)時(shí)機(jī)，應(yīng)引起高度重視。對(duì)于晚期前列腺癌而不能手術(shù)患者，目前一線的治療方法是內(nèi)分泌和/或者化療，以達(dá)到人工去勢(shì)目的，即去雄治療。對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，這種治療早期效果是滿意的，但多數(shù)這樣的患者會(huì)在三年左右復(fù)發(fā)，目前缺乏對(duì)于晚期前列腺癌的有效治療方法，最終導(dǎo)致患者死亡。 MSCs(mesenchymal stem cells,間充質(zhì)干細(xì)胞)是一種具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。作為一種新型治療手段具有廣闊前景。自體干細(xì)胞容易獲得且副作用小，避免了組織相容性不符和倫理學(xué)障礙等難題。此外，人們發(fā)現(xiàn)MSCs與腫瘤細(xì)胞之間的關(guān)系非常密切。MSCs可以被募集到腫瘤組織參與腫瘤微環(huán)境的重塑，二者之間的交互對(duì)話(crosstalk)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等力學(xué)生物學(xué)行為產(chǎn)生了重要影響，，但其具體機(jī)制尚不明確。 miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子。新近研究表明，miRNA通過(guò)負(fù)性調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。由于單一miRNA能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，研究miRNA及其作用的靶基因能更加清晰的闡明miRNA在腫瘤的生物學(xué)行為中發(fā)揮的作用。到目前為止，僅有少數(shù)miRNA被證實(shí)參與了前列腺癌的進(jìn)展。我們?cè)诩韧难芯恐校胢iRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，率先發(fā)現(xiàn)在雄激素非依賴(lài)前列腺癌與雄激素依賴(lài)性前列腺癌癌存在多個(gè)差異表達(dá)的miRNA分子，并初步證實(shí)miR-663可以作為晚期前列腺癌的獨(dú)立預(yù)后分子。Alex Yuan等研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以攜帶并釋放miRNA分子而發(fā)揮相應(yīng)功能。結(jié)合MSCs對(duì)腫瘤的交互作用，我們有理由相信miRNA可以作為重要線索來(lái)揭示MSCs對(duì)前列腺癌生物學(xué)的影響。 二、研究目的 針對(duì)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以明顯抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖和侵襲的基礎(chǔ)上，利用miRNA芯片篩選，得到在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制后的前列腺癌細(xì)胞與親本前列腺癌細(xì)胞中成差異表達(dá)的miRNA表達(dá)譜，明確表達(dá)差異最明顯的miRNA并在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液水平上進(jìn)行驗(yàn)證，用多個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-29c的潛在靶基因，隨后對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行GO功能聚類(lèi)和pathway分析，初步判定并驗(yàn)證miR-29c的潛在靶基因（C7ORF24、COL6A2、PIK4CA）。深入探討miR-29c/C7ORF24、COL6A2、PIK4CA通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制前列腺癌中的作用和可能機(jī)制，為臨床治療前列腺癌提供新的策略和思路。 三、主要研究?jī)?nèi)容 1、抽取健康成人骨髓組織，分離、純化、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞技術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，為后續(xù)工作打下基礎(chǔ)。 2、通過(guò)Transwell技術(shù)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與前列腺癌LNCaP細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖及侵襲，明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生物學(xué)作用。 3、將與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞與野生型LNCaP細(xì)胞進(jìn)行miRNA篩選，選擇差異明顯的miRNA（miR-29c）在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液水平進(jìn)行驗(yàn)證，明確miR-29c是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌并傳遞到前列腺癌細(xì)胞，并檢驗(yàn)miR-29c對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生物學(xué)作用。 4、利用生物信息學(xué)分析和miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找miR-29c作用的靶基因，確定靶基因確切結(jié)合位點(diǎn)或者區(qū)域，通過(guò)Real time PCR以及Western blot試驗(yàn)，進(jìn)一步明確miR-29c對(duì)靶基因的負(fù)性調(diào)控作用。 四、結(jié)果 1、成功從健康成人骨髓組織中，分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，形態(tài)穩(wěn)定，折光性好，魚(yú)群樣生長(zhǎng)，流式細(xì)胞試驗(yàn)顯示MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD29、CD90、CD73及CD105，不表達(dá)CD14以及造血干細(xì)胞標(biāo)志分子CD34和CD45。 2、利用Transwell共培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)MSCs可以明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，證實(shí)MSCs可以抑制前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。 3、利用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，篩選出在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制后的前列腺癌細(xì)胞與親本前列腺癌細(xì)胞中成差異表達(dá)miRNA，其中miR-29c表達(dá)差異最明顯，利用real-time PCR,驗(yàn)證了miR-29c在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)miR-29c在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液（無(wú)血清培養(yǎng)）中的表達(dá)高于親本細(xì)胞的培養(yǎng)液，進(jìn)一步證明了miR-29c是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌并傳遞到前列腺癌細(xì)胞。 4、CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-29c的LNCaP細(xì)胞增殖明顯抑制，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-29c的LNCaP細(xì)胞的S期細(xì)胞明顯下降，顯示miR-29c可以抑制前列腺癌細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)。 5、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-29c的LNCaP細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯下降，提示miR-29c抑制了LNCaP細(xì)胞的侵襲能力。 6、采用多個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-29c的潛在靶基因，隨后對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行GO功能聚類(lèi)和pathway分析，初步判斷其可能的靶基因?yàn)镃7orf24、COL6A2、PIK4CA。對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c后，經(jīng)過(guò)real time-PCR和Western blot試驗(yàn)證實(shí)C7orf24、COL6A2、PIK4CA三個(gè)基因在mRNA和蛋白水平明顯下降，表明C7orf24、COL6A2、PIK4CA可能是miR-29c的靶基因。 五、結(jié)論 1、本研究通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的體外功能試驗(yàn)表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)增加LNCaP細(xì)胞S期細(xì)胞的數(shù)量，從而促進(jìn)LNCaP細(xì)胞的增殖。同時(shí)也證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)增加前列腺癌LNCaP細(xì)胞穿過(guò)Transwell基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量而增加LNCaP細(xì)胞的侵襲能力。因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)在前列腺癌的生長(zhǎng)及進(jìn)展期發(fā)揮重要作用。 2、通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，篩選出在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制后的前列腺癌細(xì)胞與親本前列腺癌細(xì)胞中成差異表達(dá)最明顯的miR-29c,并在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液水平驗(yàn)證了miR-29c的差異表達(dá)，表明是miR-29c由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌并傳遞到前列腺癌細(xì)胞，miR-29c可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制前列腺癌細(xì)胞的關(guān)鍵分子。 3、通過(guò)對(duì)LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-29c可以明顯抑制LNCaP細(xì)胞的增殖和侵襲能力。這也在一定程度上證明miR-29c可以抑制前列腺癌的生物學(xué)行為。 4、通過(guò)對(duì)其靶基因的尋找發(fā)現(xiàn)C7orf24、COL6A2、PIK4CA可能是改變LNCaP細(xì)胞增殖侵襲能力的重要靶蛋白。然而miR-29c往往作用于多個(gè)通路及蛋白，miR-29c與蛋白的結(jié)合仍需報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)予以完善。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;2011版《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》出版發(fā)行[J];泌尿外科雜志(電子版);2011年03期

2 Shalini Vellasamy;Pratheep Sandrasaigaran;Sharmili Vidyadaran;Elizabeth George;Rajesh Ramasamy;;Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells derived from human placenta tissue[J];World Journal of Stem Cells;2012年06期

本文編號(hào)：1692369