本文選題：腎癌　切入點：Folliculin　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 腎癌約占成人惡性腫瘤的2%-3%,其中大部分為散發(fā)性腎癌,約4%的病例為遺傳性腎癌。了解遺傳性腎癌的發(fā)病機(jī)制對腎癌治療有著重要的意義,目前已明確的遺傳性腎癌包括：①VHL綜合征；②遺傳性乳頭狀腎癌；③遺傳性平滑肌瘤病腎癌；④BHD(Birt-Hogg-Dube)綜合征。BHD綜合征是一種常染色體顯性遺傳病,其臨床主要表現(xiàn)為多發(fā)性纖維毛囊瘤,多發(fā)性肺囊腫,自發(fā)性氣胸及腎臟腫瘤。BHD綜合征由folliculin (FLCN)基因缺失突變引起,研究表明FLCN基因位于常染色體17p11.2,編碼含579個氨基酸的FLCN蛋白。FLCN蛋白與FNIP1、 FNIP2蛋白相結(jié)合,參與調(diào)節(jié)mTOR和AMPK信號通路,但其具體功能尚需進(jìn)一步研究。 對于BHD綜合征伴發(fā)的雙側(cè)腎癌,目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。2006年Youfeng Yang等建立了第一個源自BHD腎癌患者的腎癌細(xì)胞系U0K257,2011年XiaohongLu等建立了穩(wěn)定表達(dá)FLCN蛋白的細(xì)胞系U0K257-2,并發(fā)現(xiàn)化療藥物紫杉醇對UOK257細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于U0K257-2,但并未深入研究這一現(xiàn)象的作用機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明,相對于高表達(dá)FLCN蛋白的腎癌細(xì)胞,紫杉醇在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,并可誘導(dǎo)更多的凋亡和自噬現(xiàn)象。 自噬又被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,其特征為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)包裹長壽命的細(xì)胞器或蛋白的雙層膜結(jié)構(gòu)(自噬體),并通過自噬體與溶酶體融合的途徑將其分解消化的一系列生化反應(yīng)。自噬對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要的意義,在細(xì)胞遭遇饑餓等應(yīng)激情況下,細(xì)胞可以通過自噬清除受損的蛋白或細(xì)胞器并維持代謝,因此自噬被認(rèn)為是細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境下所產(chǎn)生的一種自我保護(hù)性反應(yīng)；于此同時,自噬也是細(xì)胞程序性死亡的一種方式,抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路可以明顯激活肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的自噬反應(yīng)并抑制細(xì)胞生長。大量研究表明,自噬對腫瘤細(xì)胞生長產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用取決于腫瘤的種類以及外界刺激等各種因素。正確的選擇自噬激活劑或抑制劑,從而加強(qiáng)細(xì)胞的自噬性死亡或抑制細(xì)胞的保護(hù)性自噬,可以增強(qiáng)抗癌藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用并提高對腫瘤的治療效果,因此有必要深入研究藥物對腫瘤自噬的影響,以及所誘導(dǎo)自噬的種類。我們的研究結(jié)果表明,紫杉醇可以誘導(dǎo)FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬,而應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可以明顯強(qiáng)化紫杉醇的細(xì)胞毒作用。 研究表明,紫杉醇可以在不同的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡,但其是否能在細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬尚存在爭議。為了確認(rèn)紫杉醇可以在FLCN缺失腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬反應(yīng),我們除了應(yīng)用U0K257/U0K257-2細(xì)胞外,還以腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN作為對照,建立了FLCN表達(dá)下調(diào)的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN5968。我們的研究結(jié)果表明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬,但在FLCN高表達(dá)的細(xì)胞中自噬水平無明顯變化,聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑和紫杉醇可能成為治療BHD腎癌的一條有效途徑。 目的 研究紫杉醇誘導(dǎo)的自噬現(xiàn)象對FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制,探討聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑和紫杉醇對BHD綜合征伴發(fā)腎癌的治療效果。 材料與方法 1.細(xì)胞 本實驗使用2組細(xì)胞：U0K257/U0K257-2, ACHN5968/ACHN-sct其中U0K257不表達(dá)FLCN蛋白,U0K257-2是在UOK257細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FLCN基因并穩(wěn)定表達(dá)FLCN蛋白的細(xì)胞系；ACHN-sc是在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN中轉(zhuǎn)入空白質(zhì)粒的細(xì)胞,ACHN5968是利用siRNA技術(shù)將ACHN中FLCN表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞系。 2.細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡的測定 細(xì)胞活性由MTT法測定：U0K257/U0K257-2和ACHN5968/ACHN-sc細(xì)胞種于96孔板中,實驗組加入100nM紫杉醇,對照組加入等量PBS,分別在0、24、48、72小時在96孔板中加入MTT (5mg/ml)并測量其0D值。細(xì)胞凋亡由TUNEL及DAPI染色法測定。TUNEL:實驗組及對照組單層細(xì)胞種于96孔板中,利用TUNEL試劑盒(HTTiterTACSTMAssay kit, TREVIGEN(?))測定凋亡細(xì)胞數(shù)量。DAPI染色：細(xì)胞經(jīng)固定后,經(jīng)過DAPI染色(利用1x PBS1：2000稀釋),于熒光顯微鏡下觀察并比較實驗組和對照組細(xì)胞核形態(tài)。另外,本組實驗還通過cleaved caspase-3蛋白的western blot結(jié)果間接比較實驗組和對照組細(xì)胞凋亡差別。 3.細(xì)胞自噬的檢測 (1)電子顯微鏡觀察自噬體 利用電子顯微鏡觀察自噬體是檢測細(xì)胞自噬的經(jīng)典方法。本組實驗中,U0K257/U0K257-2和ACHN5968/ACHN-sc細(xì)胞種于10cm培養(yǎng)皿中,實驗組加入100nM紫杉醇,對照組加入等量PBS,24小時后按透射電鏡標(biāo)本制作要求制作標(biāo)本,透射電鏡下觀察并拍照。電鏡下自噬體特征為雙層膜結(jié)構(gòu),自噬體內(nèi)有時可觀察到未消化的包漿成分或殘存的細(xì)胞器。 (2) GFP-LC3免疫熒光分析 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1light chain3,LC3)位于自噬體膜上,與自噬體數(shù)量密切相關(guān)。通過免疫熒光的方法可以觀察到自噬誘導(dǎo)后的GFP-LC3點狀聚集增多。本組實驗中,各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,24小時后加入100nM紫杉醇或PBS,再過24小時后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒,并計算平均每組細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的數(shù)量。 (3)單丹磺酰戊二胺熒光分析 單丹磺酰戊二胺(monodansyl cadaverine, MDC)可以使自噬體發(fā)出藍(lán)色熒光,從而成為觀察自噬的一種輔助方法。本組實驗中,各組細(xì)胞種于6孔板中,加入0.05mM MDC并在37℃條件下等待20分鐘,然后固定細(xì)胞并于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒,計算平均每組細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的數(shù)量。 (4)LC3和P62蛋白印跡分析(western blot) LC3蛋白是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。LC3蛋白又分為LC3-I和LC3-Ⅱ兩種形式,當(dāng)自噬體形成后,LC3-I與磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamines,PE)結(jié)合形成LC3-Ⅱ, LC3-Ⅱ位于自噬體膜上,并最終隨自噬體被溶酶體降解。在實際實驗中,藥物誘導(dǎo)后的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高可以由自噬水平升高引起,但也可能由溶酶體功能受到抑制且自噬水平降低引起,為區(qū)分這兩種原因,一般先用溶酶體抑制劑處理細(xì)胞,然后再檢測藥物誘導(dǎo)后的LC3-Ⅱ蛋白水平。本組實驗中,利用蛋白印跡方法檢測并比較各組細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白含量,并利用溶酶體抑制齊bafilomycin Al處理細(xì)胞后,再次檢測細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白含量。另外,本組實驗還檢測各組細(xì)胞中P62蛋白含量,以進(jìn)一步證實細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)。 4.ERK信號通路的檢測 本組實驗利用蛋白印跡方法檢測MEK, ERK及P-ERK蛋白水平,從而確定ERK信號通路的激活是紫杉醇誘導(dǎo)缺乏FLCN表達(dá)的腎癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬的關(guān)鍵機(jī)制。本組實驗檢測了各組細(xì)胞中FLCN,MEK,ERK,P-ERK,LC3-Ⅰ/Ⅱ及beclin-Ⅰ蛋白表達(dá)水平,并應(yīng)用P-ERK抑制劑U0126處理細(xì)胞后,再次檢測P-ERK, LC3-Ⅰ/Ⅱ及beclin-I蛋白表達(dá)變化。 5.自噬功能的檢測 為了判定細(xì)胞自噬對紫杉醇毒性的影響,本組實驗分別利用自噬抑制劑和基因沉默技術(shù)抑制自噬,觀察并比較自噬抑制前后紫杉醇對細(xì)胞毒性作用的變化。各組細(xì)胞經(jīng)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)處理或轉(zhuǎn)染beclin1siRNA后,檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表達(dá)變化,并利用MTT和TUNEL方法比較自噬抑制前后紫杉醇對細(xì)胞毒性作用的變化。 6.統(tǒng)計學(xué)分析 本課題利用SPSS軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或t檢驗。所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p0.05表示具有顯著性差異。 結(jié)果 1.紫杉醇對細(xì)胞活性及凋亡的影響經(jīng)紫杉醇處理后,U0K257/U0K257-2和ACHN5968/ACHN-sc細(xì)胞的細(xì)胞生長均受到抑制,與對照組細(xì)胞(U0K257-2、 ACHN-sc)相比, FLCN缺失或下調(diào)的細(xì)胞(UOK257、ACHN5968)生長曲線下降更為明顯。TUNEL和DAPI染色結(jié)果顯示,加入紫杉醇后,與U0K257-2和ACHN-sc相比,U0K257和ACHN5968細(xì)胞凋亡更加明顯,且凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3有顯著升高。以上實驗結(jié)果表明,與高表達(dá)FLCN的腎癌細(xì)胞相比,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調(diào)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更明顯的細(xì)胞凋亡和生長抑制。2.紫杉醇對細(xì)胞自噬的影響經(jīng)紫杉醇處理后,U0K257-2和ACHN-sc細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)無明顯變化,而U0K257和ACHN5968細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高；經(jīng)溶酶體抑制劑bafilomycin Al處理后各組細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)均有所升高,相比于U0K257-2和ACHN-sc細(xì)胞,U0K257和ACHN5968細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白升高更加明顯。GFP-LC3和MDC分析結(jié)果顯示,與UOK257-2和ACHN-sc細(xì)胞相比,經(jīng)紫杉醇處理后U0K257和ACHN5968細(xì)胞內(nèi)可見熒光點狀聚集顯著增加(p0.05),電子顯微鏡下可見UOK257和ACHN5968細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的自噬體。以上實驗結(jié)果證明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)明顯的自噬現(xiàn)象。 3.紫杉醇誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制western blot結(jié)果表明,FLCN蛋白參與MAPK信號通路的調(diào)節(jié)。與U0K257-2和ACHN-sc相比,U0K257和ACHN5968細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路被明顯激活,通路關(guān)鍵蛋白P-MEK和P-ERK都有顯著升高。根據(jù)文獻(xiàn)報道,ERK信號通路可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞自噬,本組實驗中,紫杉醇可以進(jìn)一步升高U0K257和ACHN5968細(xì)胞中P-ERK和Beclin-1蛋白水平,而利用U0126抑制P-ERK表達(dá)后,細(xì)胞內(nèi)Beclin-1和LC3-Ⅱ水平均有明顯下降,GFP-LC3實驗結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)熒光點狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯減少。本組實驗結(jié)果證明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞內(nèi)激活ERK通路并升高Beclin-1蛋白表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。 4.自噬對紫杉醇藥效及細(xì)胞生長的影響經(jīng)自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞后,紫杉醇未能在U0K257和ACHN5968細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬,加入紫杉醇后細(xì)胞LC3-Ⅱ水平無明顯改變。MTT和TUNEL結(jié)果顯示,加入3-MA后,紫杉醇對UOK257和ACHN5968細(xì)胞的毒性作用明顯增強(qiáng),并能在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)更明顯的凋亡。利用基因沉默技術(shù)抑制自噬可以得到相似的結(jié)果,通過下調(diào)Beclin-1蛋白表達(dá)抑制自噬后,U0K257和ACHN5968細(xì)胞對紫杉醇更加敏感。本組實驗結(jié)果表明,紫杉醇可以在殺傷UOK257和ACHN5968腎癌細(xì)胞的同時誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)保護(hù)性自噬,聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇和自噬抑制劑可能會對BHD伴發(fā)的腎癌有更明顯的治療效果。 結(jié)論 1.與高表達(dá)FLCN的細(xì)胞相比,紫杉醇對FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞有更明顯的細(xì)胞毒作用。 2.紫杉醇在FLCN缺失或下調(diào)的細(xì)胞內(nèi)激活ERK通路并上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。 3.抑制自噬可以增強(qiáng)紫杉醇對FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞的毒性作用,聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑和紫杉醇可能成為治療BHD相關(guān)性腎癌的有效途徑。 研究意義及創(chuàng)新性 1.本課題實驗結(jié)果首次表明紫杉醇可以在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬,并進(jìn)一步揭示了紫杉醇誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制為ERK通路的激活以及Beclin1蛋白表達(dá)的增強(qiáng)。 2.本課題結(jié)果表明抑制自噬可以增強(qiáng)紫杉醇對FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,并提出聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑和紫杉醇可能會成為治療BHD相關(guān)性腎癌的有效途徑。 研究背景 腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,大約有25%-30的腎癌患者在初次診斷時就已發(fā)現(xiàn)有局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。局限性腎癌首選治療方法為根治性腎切除術(shù),但術(shù)后約1/3患者將出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。晚期腎癌預(yù)后較差,對放療和化療都不敏感。盡管最近有文獻(xiàn)報告重離子放療可能對腎癌有較好的治療效果,但目前臨床上放療僅被用作腎癌治療的輔助方法。研究表明腎癌的發(fā)生可能與部分抑癌基因如VHL, FLCN, MET等基因功能喪失有關(guān),其中FLCN基因缺失常誘發(fā)BHD綜合征,患者可伴有雙側(cè)腎腫瘤,而針對FLCN基因缺陷的腎腫瘤目前尚無有效的治療方法。本課題研究發(fā)現(xiàn),相較于其他類型的腎癌細(xì)胞,FLCN缺失的腎癌細(xì)胞對γ線放射更加敏感,且在經(jīng)受放射后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)更明顯的自噬現(xiàn)象。 自噬是一種正常的細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng),可以在細(xì)胞經(jīng)受饑餓等生存壓力時為細(xì)胞提供能量和營養(yǎng)成分。在腫瘤細(xì)胞中自噬水平可能出現(xiàn)異常,并根據(jù)細(xì)胞種類和外界刺激的不同,出現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)胞生命力增強(qiáng)或者啟動細(xì)胞程序性死亡這兩種截然相反的結(jié)果。目前自噬在腫瘤治療中的應(yīng)用是熱門研究領(lǐng)域之一,而自噬對腫瘤放療敏感性的影響尚未清楚。在多項體外實驗中,自噬抑制劑氯喹可以明顯增強(qiáng)腫瘤對放療的敏感性,但也有研究表明放療可以通過激活細(xì)胞的自噬性死亡殺傷腫瘤細(xì)胞,如Selvakumar Anbalagan等研究發(fā)現(xiàn)γ線放射可以在VHL基因缺陷的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬,而利用自噬誘導(dǎo)劑可以增強(qiáng)腎癌細(xì)胞對放療的敏感性。 為了檢測Y線放射對FLCN基因缺陷腎腫瘤的治療效果,本實驗比較FLCN缺失的腎癌細(xì)胞與其他類型腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性差別,并檢測FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞與對照組細(xì)胞在經(jīng)過γ線放射后凋亡及自噬水平上的差別。根據(jù)抑制或進(jìn)一步激活自噬后細(xì)胞對γ線放射敏感性的變化,進(jìn)一步確定自噬對FLCN基因缺失的腎癌細(xì)胞放療敏感性的影響。 目的 1.檢測FLCN缺失的腎癌細(xì)胞對Y線放射的敏感性。 2.在經(jīng)過γ線放射后,檢測FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞與高表達(dá)FLCN的腎癌細(xì)胞在凋亡及自噬水平上的差別。 3.檢測自噬對FLCN基因缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞放療敏感性的影響。 4.檢測γ線放射在FLCN基因缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制。 材料和方法 1.細(xì)胞 為確定FLCN對腎癌γ線放射敏感性的影響,本實驗使用ACHN,786-0,769-P, Caki-1和UOK257五種人腎癌細(xì)胞進(jìn)行γ線放射后的克隆存活分析實驗。為檢測自噬對FLCN基因缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞γ線放射敏感性的影響,本實驗使用2組細(xì)胞：UOK257/UOK257-2, ACHN5968/ACHN-sc。其中UOK257是源自BHD綜合征患者的FLCN基因缺失的腎癌細(xì)胞系,UOK257-2是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的穩(wěn)定表達(dá)FLCN的細(xì)胞系；ACHN5968是利用siRNA技術(shù)將腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN中FLCN表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞系,ACHN-sc是在ACHN中轉(zhuǎn)入對照空白質(zhì)粒的細(xì)胞。 2.克隆存活分析實驗 ACHN,786-0,769-P, Caki-1和UOK257細(xì)胞種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,經(jīng)過OGy、1Gy、3Gy和5Gy的γ線放射后,在正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14天,形成的細(xì)胞克隆經(jīng)0.5%的結(jié)晶紫染色后計數(shù)。為進(jìn)一步檢測FLCN對腎癌細(xì)胞放療敏感性的影響,將2組細(xì)胞UOK257/UOK257-2, ACHN5968/ACHN-sc種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,經(jīng)過OGy、1Gy、3Gy、5Gy和7Gy的γ線放射后,再次進(jìn)行細(xì)胞克隆的培養(yǎng)、染色和計數(shù)。根據(jù)實驗結(jié)果計算各組細(xì)胞的細(xì)胞生存指數(shù)(Surviving fraction, SF):SF=平均細(xì)胞克隆數(shù)／初始細(xì)胞種植數(shù)×種植效率(plating efficiency, PE), PE=無放射對照組平均細(xì)胞克隆數(shù)／無放射對照組初始細(xì)胞種植數(shù)。 3.γ線放射對細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡由TUNEL法測定：將UOK257/UOK257-2, ACHN5968/ACHN-sc單層細(xì)胞種于96孔板中,經(jīng)OGy、3Gy和5Gy的γ線放射后,利用TUNEL試劑盒測定凋亡細(xì)胞數(shù)量。提取放射后各組細(xì)胞總蛋白,利用western blot方法檢測cleaved caspase-3蛋白含量,進(jìn)而間接比較實驗組和對照組細(xì)胞凋亡差別。 4.丫線放射后細(xì)胞自噬的檢測 細(xì)胞自噬通過MDC、GFP-LC3熒光分析以及LC3蛋白印跡分析三種方法檢測。IMDC熒光分析：各組細(xì)胞種于6孔板中,經(jīng)OGy、3Gy、5Gy的γ線放射后于正常培養(yǎng)條件下等待7小時,加入0.05mM MDC并在37℃條件下等待20分鐘,固定細(xì)胞后利用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒數(shù)量。GFP-LC3熒光分析：各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,24小時后細(xì)胞經(jīng)OGy、3Gy和5Gy的Y線放射并于正常培養(yǎng)條件下等待7小時,利用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒數(shù)量。LC3蛋白印跡分析：各組細(xì)胞經(jīng)γ線放射后于正常培養(yǎng)條件下等待7小時,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜及抗體結(jié)合,觀察比較各組細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白含量。 5.檢測自噬對細(xì)胞γ線放射敏感性的影響 利用自噬抑制劑或基因沉默技術(shù)抑制細(xì)胞自噬后,對各組細(xì)胞進(jìn)行γ線放射,通過克隆存活分析實驗比較自噬抑制組和對照組細(xì)胞的生存指數(shù)曲線。為進(jìn)一步證實自噬對細(xì)胞丫線放射敏感性的影響,本實驗使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理細(xì)胞,并觀察比較自噬誘導(dǎo)組和對照組細(xì)胞經(jīng)γ線放射后的生存指數(shù)曲線。 6.自噬分子機(jī)制的檢測 為探討γ線放射在FLCN缺失的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制,本實驗利用western blot檢測ERK信號通路的關(guān)鍵蛋白ERK/P-ERK,以及自噬調(diào)節(jié)蛋白Bceclin1,并利用基因沉默技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)Bceclin1蛋白表達(dá)后,再次檢測經(jīng)γ線放射后細(xì)胞自噬的變化。 7.統(tǒng)計學(xué)分析 本組實驗利用SPSS軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或t檢驗。所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p0.05表示具有顯著性差異。 結(jié)果 1.FLCN降低腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性ACHN,786-0,769-P,Caki-1和UOK257五種人腎癌細(xì)胞中,ACHN細(xì)胞內(nèi)FLCN蛋白含量最高,UOK257不表達(dá)FLCN蛋白。克隆存活分析實驗結(jié)果顯示,經(jīng)γ線放射后,ACHN細(xì)胞生存指數(shù)最高,UOK257細(xì)胞生存指數(shù)最低,表明FLCN可以降低腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性。 2. FLCN增加丫線放射后腎癌細(xì)胞的凋亡對UOK257/和UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc兩組細(xì)胞進(jìn)行γ線放射后,TUNEL實驗結(jié)果顯示所有細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)量均有所增加,而相較于FLCN缺失或下調(diào)的細(xì)胞(UOK257.ACHN5968),高表達(dá)FLCN的細(xì)胞(UOK257-2.ACHN-sc)凋亡更加明顯(p0.05)。Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)γ線放射后,UOK257-2和ACHN-sc細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于UOK257和ACHN5968細(xì)胞,間接證明經(jīng)γ線放射后高表達(dá)FLCN的細(xì)胞凋亡更加明顯。 3.FLCN對γ線放射后腎癌細(xì)胞內(nèi)自噬的影響對UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc兩組細(xì)胞進(jìn)行γ線放射后,MDC和GFP-LC3結(jié)果均顯示UOK257和ACHN5968細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒數(shù)量高于UOK257-2和ACHN-sc細(xì)胞,表明相較于高表達(dá)FLCN的細(xì)胞,丫線放射可以在FLCN缺失或下調(diào)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更明顯的自噬。LC3-Ⅰ/Ⅱ的western blot結(jié)果顯示,與UOK257-2和ACHN-sc細(xì)胞相比,γ線放射后UOK257和ACHN5968細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高,再次證明γ線放射在FLCN缺失或下調(diào)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更明顯的自噬現(xiàn)像。 4.檢測自噬對細(xì)胞γ線放射敏感性的影響利用自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞后,各組細(xì)胞在經(jīng)γ線放射后LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)無明顯變化,顯示自噬被成功抑制。當(dāng)自噬被抑制后,UOK257和ACHN5968細(xì)胞對γ線放射的敏感性明顯降低,而UOK257-2和ACHN-sc細(xì)胞對γ線放射的敏感性無明顯改變；利用基因沉默技術(shù)抑制beclin-l蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬后,可得到相似的實驗結(jié)果,顯示自噬可以升高FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性。本實驗利用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理UOK257和ACHN5968細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高,且細(xì)胞對γ線放射的敏感性明顯升高,表明自噬誘導(dǎo)劑可以增強(qiáng)FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性。 5.自噬分子機(jī)制的檢測Western blot結(jié)果表明,在腎癌細(xì)胞中,FLCN蛋白可以下調(diào)ERK信號通路關(guān)鍵蛋白P-ERK的表達(dá)。經(jīng)過γ線放射后,UOK257和ACHN5968細(xì)胞內(nèi)P-ERK和Beclin1蛋白明顯升高,而利用基因沉默技術(shù)抑制Beclin1蛋白表達(dá)后,丫線放射未能在U0K257和ACHN5968細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬,表明γ線放射通過激活ERK信號通路并上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)從而在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中激活自噬反應(yīng)。 結(jié)論 1. FLCN可以降低腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性,無FLCN表達(dá)的UOK257腎癌細(xì)胞對丫線放射較敏感。 2.相對于高表達(dá)FLCN的細(xì)胞,γ線放射可以在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)更明顯的自噬反應(yīng)。 3.自噬可以升高FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性,應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以增強(qiáng)γ線放射對UOK257和ACHN5968細(xì)胞的殺傷作用。 4.γ線放射通過激活ERK信號通路并上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)從而在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中激活自噬反應(yīng)。 研究意義及創(chuàng)新性 1.本實驗結(jié)果首次表明FLCN可以降低腎癌細(xì)胞對γ線放射的敏感性,且相對于高表達(dá)FLCN的細(xì)胞,γ線放射可以在FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)更明顯的自噬反應(yīng)。 2.本實驗結(jié)果表明應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以增強(qiáng)γ線放射對FLCN缺失或下調(diào)的腎癌細(xì)胞的殺傷作用,并提出聯(lián)合應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑和γ線放射可能會對BHD相關(guān)性腎癌具有較好的治療效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1672139