本文選題：klotho　切入點(diǎn)：腎臟纖維化　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：1997年,一個(gè)科學(xué)小組意外獲得一種基因變異的小鼠。這種小鼠的表型同人類衰老表型很相似,因此將這一小鼠以希臘神話中主管生命長(zhǎng)度的女神klotho命名。klotho變異純合子(kl/kl)小鼠出生三周內(nèi)并沒有表現(xiàn)出與野生型小鼠不同的表型。出生三周以后表現(xiàn)為明顯的發(fā)育停滯,嚴(yán)重的血管壁鈣化,皮下脂肪萎縮,肺氣腫,骨質(zhì)疏松,缺少發(fā)育成熟的生殖系統(tǒng),壽命縮短等酷似人類衰老現(xiàn)象的表型。腎臟是Klotho蛋白的主要表達(dá)場(chǎng)所,大腦脈絡(luò)叢也少量表達(dá)Klotho蛋白。Klotho蛋白有兩種存在形式。一種是單次跨膜蛋白,作為FGF23受體的共同受體而發(fā)揮作用。FGF23屬于Fibroblast Growth Factor家族,主要來(lái)源于骨組織。在腎近曲小管上皮細(xì)胞表面存在FGF23的受體。在Klotho存在的條件在,FGF23特異性的和它的受體結(jié)合,激活下游信號(hào)通路,抑制原尿中磷的重吸收,從而維持血液循環(huán)中磷的生理濃度。FGF23與受體結(jié)合后還可以抑制合成活性維生素D的關(guān)鍵酶Cyp27b1,從而抑制活性維生素D的合成。因此,同F(xiàn)GF23-deficient小鼠相似,kl/kl小鼠也表現(xiàn)為高血磷和高血活性維生素D。Klotho蛋白的另一種存在形式是作為一種分泌蛋白。與細(xì)胞膜結(jié)合的Klotho在一些膜錨定蛋白酶,比如ADAM10、ADAM17或者BACE1,的水解作用下,將自身膜外部分解離并釋放到血液,尿液或者腦脊液中,作為游離的體液因子參與到各種病理生理現(xiàn)象中。腎間質(zhì)纖維化(Renal tubulointerstitial fibrosis, RTF)是各種慢性腎臟疾病(CKD)的最終病理表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)累積,成纖維母細(xì)胞的激活并伴隨著有功能腎單位的減少。小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)是人CKD的動(dòng)物模型。UUO施術(shù)后,尿液淤積在腎盂內(nèi),壓迫導(dǎo)致腎小管擴(kuò)張,管型形成,炎細(xì)胞浸潤(rùn),局部炎性因子表達(dá)升高,腎小管間質(zhì)纖維化等,很好的模擬了人類慢性腎臟病的局部腎臟表現(xiàn),是研究人類CKD的理想動(dòng)物模型。近幾年的研究表明Klotho蛋白在RTF發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。比如Klotho在CKD病人的腎臟中表達(dá)下調(diào),并且它的下調(diào)水平同疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。在kl/kl小鼠腎臟中,炎性因子和纖維化標(biāo)記性因子表達(dá)均上調(diào)。UUO術(shù)后,klotho變異雜合子(kl/+)小鼠較野生型小鼠腎臟纖維化和各種炎性因子上調(diào)程度更為嚴(yán)重。另有很多報(bào)道,外源性Klotho蛋白能夠顯著緩解各種原因?qū)е碌哪I臟損傷。因此,現(xiàn)有的研究都支持Klotho蛋白是一種腎臟保護(hù)蛋白。Klotho蛋白被認(rèn)為能夠拮抗UUO術(shù)后TGF-β信號(hào)通路和Wnt/β -catenin信號(hào)通路的激活,從而緩解UUO導(dǎo)致的RTF。已有的報(bào)道都是利用kl/+小鼠和野生型小鼠UUO術(shù)后對(duì)于RTF的比較,很好的支持了這一結(jié)論。然而不同于野生型和kl/+小鼠,kl/kl小鼠具有完全不同的表型,其中循環(huán)中顯著升高的磷,活性維生素D3和FGF23濃度是最為典型的特征,也就是說(shuō)kl/kl小鼠處于嚴(yán)重的內(nèi)環(huán)境紊亂狀態(tài)。有報(bào)道指出活性維生素D3和它的異構(gòu)體也是一種腎臟保護(hù)因子。比如,在人子宮平滑肌瘤中活性維生素D3能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維化標(biāo)記的基因表達(dá)；活性維生素D3的異構(gòu)體maxacalcito能夠?qū)PM1A/VDR復(fù)合體募集到pSmad3上加速后者的去磷酸化。也就是說(shuō)在kl/kl小鼠中活性維生素D3的升高和Klotho蛋白的不足在RTF發(fā)展中的作用是相反的。至今為止還有沒有高血磷和高血FGF23對(duì)于腎臟纖維化影響的報(bào)道。因此,kl/kl小鼠UUO施術(shù)后,紊亂的內(nèi)環(huán)境是否會(huì)影響腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展,我們不得而知。目的：1.本課題以kl/kl小鼠為模型,研究UUO誘導(dǎo)的腎臟纖維化和Klotho缺失以及內(nèi)環(huán)境紊亂的關(guān)系。2.體外培養(yǎng)原代小鼠腎小管上皮細(xì)胞(PTECs),在單一的環(huán)境下,研究各基因型小鼠腎小管上皮細(xì)胞在TGF-betal刺激后,Smad3磷酸化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記的基因表達(dá)水平。明確高血磷,高血活性維生素D3以及高血FGF23在腎臟纖維化中分別的單獨(dú)作用。3.通過飼育特殊飲食扭轉(zhuǎn)kl/kl小鼠表型后檢測(cè)正常體液內(nèi)環(huán)境下,UUO施術(shù)誘導(dǎo)的RTF是否發(fā)生改變研究方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：klotho基因沉默雜合子(kl/+)小鼠購(gòu)買自日本CLEA公司,kl/+交配后獲得子代kl/kl小鼠和野生型小鼠。各組小鼠普通喂養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)光照及采食。2. 腎臟纖維化模型：?jiǎn)蝹?cè)輸尿管結(jié)扎或者對(duì)照組3天或者7天后,處死小鼠,摘取結(jié)扎腎臟或者對(duì)照腎臟,分為三等分,分別提取蛋白質(zhì),mRNA或者福爾馬林固定,制作石蠟切片。3. 原代近曲小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)：使不同基因型腎臟上皮細(xì)胞處于同樣的培養(yǎng)環(huán)境,排出kl/kl小鼠內(nèi)環(huán)境紊亂對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾4. 大鼠永生化腎臟上皮細(xì)胞系NRK52E按培養(yǎng)條件要求進(jìn)行培養(yǎng)5. TGF-β 1刺激誘導(dǎo)EMT實(shí)驗(yàn)：上述兩種細(xì)胞,標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,無(wú)血清饑餓12小時(shí)后,培養(yǎng)基中加入外源性TGF-p 1培養(yǎng)12或者24小時(shí)。收集細(xì)胞檢測(cè)EMT指標(biāo)的表達(dá)情況。6. 內(nèi)環(huán)境紊亂體外模擬實(shí)驗(yàn)：NRK52E細(xì)胞分別在含有2mM,4mM NaH2PO4,外源性FGF23和外源性的活性維生素D3的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),以分別模擬體內(nèi)高血磷,高血FGF23和高血活性維生素D3狀態(tài)。7. 免疫組織化學(xué)或者免疫熒光染色檢測(cè)UUO術(shù)后及對(duì)照組腎臟纖維化標(biāo)記αSMA、Collagen I的表達(dá)及分布和Smad3磷酸化情況。8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎組織a SMA、Collagen I的mRNA水平和體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)基因(a SMA、Collagen I和E-cadherin)的mRNA水平。9. Western Blot方法檢測(cè)TGF-betal誘導(dǎo)EMT相關(guān)蛋白水平和組織、細(xì)胞內(nèi)Smad3磷酸化水平。10. ELISA方法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)UUO施術(shù)前后TGF-β 1的蛋白質(zhì)含量。11.收集血清,檢測(cè)活性維生素D3的含量。12.對(duì)于同周齡各組基因型小鼠測(cè)量體重。13.內(nèi)環(huán)境紊亂挽救實(shí)驗(yàn)：kl/kl小鼠分別飼育正常飼料和不含維生素D3的特制飼料,觀察檢測(cè)其表型變化以及UUO術(shù)后腎臟纖維化標(biāo)記的表達(dá)水平。14.采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Student's t-test檢驗(yàn)和one-way ANOVA with a Student-Newman-Keuls test檢驗(yàn)。結(jié)果：1、UUO術(shù)后各基因型小鼠呈現(xiàn)不同的RTF水平普通飲食6周齡的各基因型小鼠施UUO手術(shù)或者假手術(shù)作為對(duì)照。取術(shù)后3天和7天標(biāo)本,針對(duì)RTF指標(biāo)a SMA、Collagen I進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和qPCR檢測(cè)。相較于野生型小鼠,kl/+小鼠a SMA、Collagen I表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)；然而kl/kl小鼠a SMA、Collagen I染色并沒有因?yàn)閗lotho蛋白的完全缺失表現(xiàn)出明顯上調(diào),相反的,相較于kl/+小鼠a SMA、CollagenI的表達(dá)明顯下調(diào)了。在對(duì)照組中,WT和kl/+小鼠a SMA、Collagen I染色幾乎是陰性,并且沒有差異,而在kl/kl小鼠中a SMA、Collagen I染色明顯陽(yáng)性(P0.05)。2、kl/kl小鼠結(jié)扎腎臟中TGF-β/Smad3信號(hào)通路被抑制了我們?cè)跈z測(cè)了各基因型小鼠結(jié)扎腎臟和假手術(shù)腎臟TGF-β/Smad3信號(hào)通路被激活情況。同RTF表現(xiàn)相一致,kl/+小鼠結(jié)扎腎臟中磷酸化Smad3 (pSmad3)的陽(yáng)性染色和組織內(nèi)蛋白含量均明顯升高,TGF-β1的蛋白和mRNA含量也明顯升高。kl/kl小鼠結(jié)扎腎臟中TGF-β1和pSmad3均被抑制了。而在對(duì)照組中,kl/kl小鼠pSmad3陽(yáng)性染色明顯上調(diào),可是TGF-β1的蛋白含量卻維持在一個(gè)較低的水平上。3、體外原代培養(yǎng)的kl/kl腎小管上皮細(xì)胞,TGF-β1誘導(dǎo)的EMT并沒有被抑制各基因型小鼠來(lái)源的腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中加入外源性TGF-β1誘導(dǎo)EMT。與UUO不同,kl/kl細(xì)胞EMT指標(biāo)(a SMA、Collagen I和E-cadherin)和pSmad3并沒有被抑制。相較于wt細(xì)胞,kl/kl細(xì)胞核kl/+細(xì)胞EMT指標(biāo)均上調(diào)了,并且二者間沒有差異(P0.05)。結(jié)果提示kl/kl小鼠UUO后RTF指標(biāo)的上調(diào)失敗和TGF-β/Smad3信號(hào)通路抑制是紊亂的內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致的而不是由于Klotho蛋白的完全缺失導(dǎo)致的。4、TGF-β1誘導(dǎo)的EMT可以被1,25(OH)2 vitamin D3抑制NRK52E細(xì)胞分別在含有高磷酸鹽(2mM,4mM),高FGF23 (0.2 μg/ml,2 μg/ml)或者高1,25(OH)2 vitamin D3 (0.1 μg/ml,1μg/ml)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。添加外源性TGF-β1到上述培養(yǎng)基后,觀測(cè)EMT指標(biāo)變化和Smad3激活情況。只有高1,25(OH)2 vitamin D3劑量依賴性的抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和Smad3激活。高磷酸鹽和高FGF23沒有產(chǎn)生任何影響。NRK52E細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)在高膦酸鹽的培養(yǎng)基中,即使不加入TGF-β1也表現(xiàn)出一定程度的Smad3激活和EMT相關(guān)基因上調(diào)。5、無(wú)維生素D飼料能夠挽救kl/kl小鼠表型,恢復(fù)UUO誘導(dǎo)的RTF相關(guān)基因的表達(dá)我們將kl/kl小鼠飼育無(wú)維生素D飼料,發(fā)現(xiàn)特殊飲食的kl/kl小鼠在表型上同野生型和kl/+沒有區(qū)別。體重和血清活性維生素D3水平都恢復(fù)到正常。比較普通飲食和特殊飲食的kl/kl小鼠UUO施術(shù)后RTF水平和TGF-β/Smad3信號(hào)通路激活水平發(fā)現(xiàn)特殊飼料組小鼠二者均顯著上調(diào)了。結(jié)論：1、kl/kl小鼠UUO后,RTF和TGF-β/Smad3信號(hào)通路被嚴(yán)重抑制；2、RTF和TGF-β/Smad3信號(hào)通路被抑制是紊亂的內(nèi)環(huán)境特別是升高的活性維生素D3導(dǎo)致的；3、表型被挽救后,kl/kl小鼠RTF和TGF-β/Smad3信號(hào)通路被激活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：1669708