本文選題：klotho　切入點：腎臟纖維化　出處：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：1997年,一個科學小組意外獲得一種基因變異的小鼠。這種小鼠的表型同人類衰老表型很相似,因此將這一小鼠以希臘神話中主管生命長度的女神klotho命名。klotho變異純合子(kl/kl)小鼠出生三周內并沒有表現(xiàn)出與野生型小鼠不同的表型。出生三周以后表現(xiàn)為明顯的發(fā)育停滯,嚴重的血管壁鈣化,皮下脂肪萎縮,肺氣腫,骨質疏松,缺少發(fā)育成熟的生殖系統(tǒng),壽命縮短等酷似人類衰老現(xiàn)象的表型。腎臟是Klotho蛋白的主要表達場所,大腦脈絡叢也少量表達Klotho蛋白。Klotho蛋白有兩種存在形式。一種是單次跨膜蛋白,作為FGF23受體的共同受體而發(fā)揮作用。FGF23屬于Fibroblast Growth Factor家族,主要來源于骨組織。在腎近曲小管上皮細胞表面存在FGF23的受體。在Klotho存在的條件在,FGF23特異性的和它的受體結合,激活下游信號通路,抑制原尿中磷的重吸收,從而維持血液循環(huán)中磷的生理濃度。FGF23與受體結合后還可以抑制合成活性維生素D的關鍵酶Cyp27b1,從而抑制活性維生素D的合成。因此,同F(xiàn)GF23-deficient小鼠相似,kl/kl小鼠也表現(xiàn)為高血磷和高血活性維生素D。Klotho蛋白的另一種存在形式是作為一種分泌蛋白。與細胞膜結合的Klotho在一些膜錨定蛋白酶,比如ADAM10、ADAM17或者BACE1,的水解作用下,將自身膜外部分解離并釋放到血液,尿液或者腦脊液中,作為游離的體液因子參與到各種病理生理現(xiàn)象中。腎間質纖維化(Renal tubulointerstitial fibrosis, RTF)是各種慢性腎臟疾病(CKD)的最終病理表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為細胞外基質(ECM)累積,成纖維母細胞的激活并伴隨著有功能腎單位的減少。小鼠單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)是人CKD的動物模型。UUO施術后,尿液淤積在腎盂內,壓迫導致腎小管擴張,管型形成,炎細胞浸潤,局部炎性因子表達升高,腎小管間質纖維化等,很好的模擬了人類慢性腎臟病的局部腎臟表現(xiàn),是研究人類CKD的理想動物模型。近幾年的研究表明Klotho蛋白在RTF發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。比如Klotho在CKD病人的腎臟中表達下調,并且它的下調水平同疾病的嚴重程度成正相關。在kl/kl小鼠腎臟中,炎性因子和纖維化標記性因子表達均上調。UUO術后,klotho變異雜合子(kl/+)小鼠較野生型小鼠腎臟纖維化和各種炎性因子上調程度更為嚴重。另有很多報道,外源性Klotho蛋白能夠顯著緩解各種原因導致的腎臟損傷。因此,現(xiàn)有的研究都支持Klotho蛋白是一種腎臟保護蛋白。Klotho蛋白被認為能夠拮抗UUO術后TGF-β信號通路和Wnt/β -catenin信號通路的激活,從而緩解UUO導致的RTF。已有的報道都是利用kl/+小鼠和野生型小鼠UUO術后對于RTF的比較,很好的支持了這一結論。然而不同于野生型和kl/+小鼠,kl/kl小鼠具有完全不同的表型,其中循環(huán)中顯著升高的磷,活性維生素D3和FGF23濃度是最為典型的特征,也就是說kl/kl小鼠處于嚴重的內環(huán)境紊亂狀態(tài)。有報道指出活性維生素D3和它的異構體也是一種腎臟保護因子。比如,在人子宮平滑肌瘤中活性維生素D3能夠抑制TGF-β誘導的纖維化標記的基因表達；活性維生素D3的異構體maxacalcito能夠將PPM1A/VDR復合體募集到pSmad3上加速后者的去磷酸化。也就是說在kl/kl小鼠中活性維生素D3的升高和Klotho蛋白的不足在RTF發(fā)展中的作用是相反的。至今為止還有沒有高血磷和高血FGF23對于腎臟纖維化影響的報道。因此,kl/kl小鼠UUO施術后,紊亂的內環(huán)境是否會影響腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展,我們不得而知。目的：1.本課題以kl/kl小鼠為模型,研究UUO誘導的腎臟纖維化和Klotho缺失以及內環(huán)境紊亂的關系。2.體外培養(yǎng)原代小鼠腎小管上皮細胞(PTECs),在單一的環(huán)境下,研究各基因型小鼠腎小管上皮細胞在TGF-betal刺激后,Smad3磷酸化和上皮間質轉化(EMT)標記的基因表達水平。明確高血磷,高血活性維生素D3以及高血FGF23在腎臟纖維化中分別的單獨作用。3.通過飼育特殊飲食扭轉kl/kl小鼠表型后檢測正常體液內環(huán)境下,UUO施術誘導的RTF是否發(fā)生改變研究方法：1.實驗動物：klotho基因沉默雜合子(kl/+)小鼠購買自日本CLEA公司,kl/+交配后獲得子代kl/kl小鼠和野生型小鼠。各組小鼠普通喂養(yǎng),標準光照及采食。2. 腎臟纖維化模型：單側輸尿管結扎或者對照組3天或者7天后,處死小鼠,摘取結扎腎臟或者對照腎臟,分為三等分,分別提取蛋白質,mRNA或者福爾馬林固定,制作石蠟切片。3. 原代近曲小管上皮細胞培養(yǎng)：使不同基因型腎臟上皮細胞處于同樣的培養(yǎng)環(huán)境,排出kl/kl小鼠內環(huán)境紊亂對實驗結果的干擾4. 大鼠永生化腎臟上皮細胞系NRK52E按培養(yǎng)條件要求進行培養(yǎng)5. TGF-β 1刺激誘導EMT實驗：上述兩種細胞,標準培養(yǎng)條件下,無血清饑餓12小時后,培養(yǎng)基中加入外源性TGF-p 1培養(yǎng)12或者24小時。收集細胞檢測EMT指標的表達情況。6. 內環(huán)境紊亂體外模擬實驗：NRK52E細胞分別在含有2mM,4mM NaH2PO4,外源性FGF23和外源性的活性維生素D3的DMEM培養(yǎng)基內進行培養(yǎng),以分別模擬體內高血磷,高血FGF23和高血活性維生素D3狀態(tài)。7. 免疫組織化學或者免疫熒光染色檢測UUO術后及對照組腎臟纖維化標記αSMA、Collagen I的表達及分布和Smad3磷酸化情況。8.實時熒光定量PCR檢測腎組織a SMA、Collagen I的mRNA水平和體外培養(yǎng)細胞內EMT相關基因(a SMA、Collagen I和E-cadherin)的mRNA水平。9. Western Blot方法檢測TGF-betal誘導EMT相關蛋白水平和組織、細胞內Smad3磷酸化水平。10. ELISA方法檢測腎臟組織內UUO施術前后TGF-β 1的蛋白質含量。11.收集血清,檢測活性維生素D3的含量。12.對于同周齡各組基因型小鼠測量體重。13.內環(huán)境紊亂挽救實驗：kl/kl小鼠分別飼育正常飼料和不含維生素D3的特制飼料,觀察檢測其表型變化以及UUO術后腎臟纖維化標記的表達水平。14.采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行Student's t-test檢驗和one-way ANOVA with a Student-Newman-Keuls test檢驗。結果：1、UUO術后各基因型小鼠呈現(xiàn)不同的RTF水平普通飲食6周齡的各基因型小鼠施UUO手術或者假手術作為對照。取術后3天和7天標本,針對RTF指標a SMA、Collagen I進行免疫組織化學染色和qPCR檢測。相較于野生型小鼠,kl/+小鼠a SMA、Collagen I表達明顯上調(P0.05)；然而kl/kl小鼠a SMA、Collagen I染色并沒有因為klotho蛋白的完全缺失表現(xiàn)出明顯上調,相反的,相較于kl/+小鼠a SMA、CollagenI的表達明顯下調了。在對照組中,WT和kl/+小鼠a SMA、Collagen I染色幾乎是陰性,并且沒有差異,而在kl/kl小鼠中a SMA、Collagen I染色明顯陽性(P0.05)。2、kl/kl小鼠結扎腎臟中TGF-β/Smad3信號通路被抑制了我們在檢測了各基因型小鼠結扎腎臟和假手術腎臟TGF-β/Smad3信號通路被激活情況。同RTF表現(xiàn)相一致,kl/+小鼠結扎腎臟中磷酸化Smad3 (pSmad3)的陽性染色和組織內蛋白含量均明顯升高,TGF-β1的蛋白和mRNA含量也明顯升高。kl/kl小鼠結扎腎臟中TGF-β1和pSmad3均被抑制了。而在對照組中,kl/kl小鼠pSmad3陽性染色明顯上調,可是TGF-β1的蛋白含量卻維持在一個較低的水平上。3、體外原代培養(yǎng)的kl/kl腎小管上皮細胞,TGF-β1誘導的EMT并沒有被抑制各基因型小鼠來源的腎小管上皮細胞進行原代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中加入外源性TGF-β1誘導EMT。與UUO不同,kl/kl細胞EMT指標(a SMA、Collagen I和E-cadherin)和pSmad3并沒有被抑制。相較于wt細胞,kl/kl細胞核kl/+細胞EMT指標均上調了,并且二者間沒有差異(P0.05)。結果提示kl/kl小鼠UUO后RTF指標的上調失敗和TGF-β/Smad3信號通路抑制是紊亂的內環(huán)境導致的而不是由于Klotho蛋白的完全缺失導致的。4、TGF-β1誘導的EMT可以被1,25(OH)2 vitamin D3抑制NRK52E細胞分別在含有高磷酸鹽(2mM,4mM),高FGF23 (0.2 μg/ml,2 μg/ml)或者高1,25(OH)2 vitamin D3 (0.1 μg/ml,1μg/ml)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。添加外源性TGF-β1到上述培養(yǎng)基后,觀測EMT指標變化和Smad3激活情況。只有高1,25(OH)2 vitamin D3劑量依賴性的抑制了TGF-β1誘導的EMT和Smad3激活。高磷酸鹽和高FGF23沒有產生任何影響。NRK52E細胞單獨培養(yǎng)在高膦酸鹽的培養(yǎng)基中,即使不加入TGF-β1也表現(xiàn)出一定程度的Smad3激活和EMT相關基因上調。5、無維生素D飼料能夠挽救kl/kl小鼠表型,恢復UUO誘導的RTF相關基因的表達我們將kl/kl小鼠飼育無維生素D飼料,發(fā)現(xiàn)特殊飲食的kl/kl小鼠在表型上同野生型和kl/+沒有區(qū)別。體重和血清活性維生素D3水平都恢復到正常。比較普通飲食和特殊飲食的kl/kl小鼠UUO施術后RTF水平和TGF-β/Smad3信號通路激活水平發(fā)現(xiàn)特殊飼料組小鼠二者均顯著上調了。結論：1、kl/kl小鼠UUO后,RTF和TGF-β/Smad3信號通路被嚴重抑制；2、RTF和TGF-β/Smad3信號通路被抑制是紊亂的內環(huán)境特別是升高的活性維生素D3導致的；3、表型被挽救后,kl/kl小鼠RTF和TGF-β/Smad3信號通路被激活。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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本文編號：1669708