本文選題：腎癌　切入點(diǎn)：凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：腎癌是威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一,近年來(lái)我國(guó)腎癌發(fā)病率、死亡率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì),在發(fā)達(dá)地區(qū)表現(xiàn)的尤為明顯。由于腎癌對(duì)放化療不敏感,因此對(duì)腎癌的治療通常采用手術(shù)直接切除的辦法。目前約30%的腎癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了癌癥的轉(zhuǎn)移,進(jìn)入腎癌的晚期,錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)期。早期腎癌患者的五年存活率約96%,而晚期腎癌患者的五年存活率僅約20%。目前對(duì)腎癌分子生物學(xué)機(jī)制的研究認(rèn)為VHL(Von Hippel-Lindau)基因功能異常是腎癌發(fā)生的關(guān)鍵步驟,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)VHL基因功能異常并不直接造成腎癌發(fā)生,提示在腎癌發(fā)生過(guò)程中存在其它重要的分子事件。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于X染色體的重要基因,目前認(rèn)為AIF具有雙重功能:在正常細(xì)胞生理活動(dòng)中通過(guò)NADH氧化還原酶活性清除氧自由基,維持氧化呼吸鏈的完整并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換;在細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)自線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞核,依賴(lài)其DNA結(jié)合能力,與相互作用蛋白形成復(fù)合物降解核酸,促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡。本文在實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)上,探討了AIF在腎癌中的表達(dá)情況、分子機(jī)制、相互作用分子以及對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,以期為腎癌分子機(jī)制和腎癌治療的研究提供新的線索。在研究過(guò)程中,首先利用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明了AIF在腎癌中的表達(dá)下調(diào)具有顯著性和頻發(fā)性。在基于Northern Blot原理的癌癥表達(dá)譜陣列分析實(shí)驗(yàn)中,以AIF c DNA為探針檢測(cè)19種組織類(lèi)型的154對(duì)癌和癌旁樣品中AIF m RNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)AIF在正常腎組織中表達(dá)最高,而在腎癌組織中具有顯著的表達(dá)下調(diào),在其它類(lèi)型的癌癥中未見(jiàn)AIF如此明顯的表達(dá)差異;利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌及癌旁樣品,發(fā)現(xiàn)85%(17/20)的腎透明細(xì)胞癌樣品中存在AIF表達(dá)水平的顯著下調(diào);在免疫組化實(shí)驗(yàn)中,84%(43/51)的腎癌組織中呈現(xiàn)AIF表達(dá)的顯著性下調(diào),而在癌旁組織樣品中具有高水平AIF表達(dá),并集中分布于近曲小管。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明AIF在腎癌中的表達(dá)下調(diào)具有顯著性和普遍性。根據(jù)AIF在正常腎組織近曲小管中高表達(dá)但在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象,并結(jié)合腎癌起源于腎小管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的事實(shí),提示AIF與腎癌發(fā)生有著重要的聯(lián)系。在進(jìn)一步探討AIF在腎癌中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),其分子機(jī)制分為遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩個(gè)層面。在一組確定了AIF表達(dá)下調(diào)的腎癌組織樣品中,采用Southern Blot雜交檢測(cè)AIF在癌癥和癌旁組織基因組中的突變,發(fā)現(xiàn)在11對(duì)樣品中有3例的腎癌組織基因組存在AIF 3′-UTR部分缺失;采用熒光原位雜交檢測(cè)另外11對(duì)AIF低表達(dá)腎癌臨床樣本,發(fā)現(xiàn)有2例存在AIF缺失。在AIF啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化分析實(shí)驗(yàn)中,在4例無(wú)AIF基因缺失,同時(shí)AIF表達(dá)下調(diào)的男性腎癌病例中,發(fā)現(xiàn)癌癥組織中AIF啟動(dòng)子區(qū)均有一定程度的甲基化,其甲基化類(lèi)型包括少量Cp G甲基化和大量非Cp G甲基化,而癌旁組織中未發(fā)現(xiàn)此類(lèi)現(xiàn)象;對(duì)腎癌細(xì)胞系Caki-1的檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游存在一個(gè)頻發(fā)的Cp T甲基化位點(diǎn);在Caki-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DNA甲基化酶抑制劑可以提高Caki-1細(xì)胞中AIF的表達(dá)水平。上述結(jié)果說(shuō)明AIF在腎癌中的表達(dá)抑制的機(jī)制包括AIF基因水平的缺失和AIF啟動(dòng)子區(qū)DNA異常甲基化。AIF在腎癌細(xì)胞中的功能不但與其表達(dá)水平相關(guān),還與其在腎癌細(xì)胞特定狀態(tài)下的相互作用因子具有直接的關(guān)系。在本研究中通過(guò)GST pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了若干AIF在腎癌細(xì)胞中的潛在相互作用蛋白,并利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了其中AIF與STK3的相互作用。STK3是Hippo信號(hào)通路中的核心蛋白,也與FOXO和RASSF1A具有相互作用,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。為了解AIF在腎癌發(fā)生和發(fā)展中的作用,本研究在腎癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AIF,發(fā)現(xiàn)STK3蛋白的磷酸化水平伴隨AIF的表達(dá)逐漸升高,而細(xì)胞內(nèi)總體STK3的表達(dá)水平基本維持不變;AIF過(guò)表達(dá)的腎癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)大量死亡;在AIF的亞細(xì)胞定位分析中發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)AIF的凋亡腎癌細(xì)胞中發(fā)生了AIF核轉(zhuǎn)位。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了AIF在腎細(xì)胞中功能的復(fù)雜性,盡管AIF在正常腎組織中高表達(dá),但在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)的AIF足以誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡,這一過(guò)程涉及AIF和多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路相互作用,以上事實(shí)為AIF的功能研究和腎癌的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上所述,通過(guò)以上對(duì)AIF在腎癌中的表達(dá)下調(diào)和機(jī)制的分析,AIF的相互作用蛋白及在腎癌中的功能研究,表明AIF在腎組織中的表達(dá)和功能具有特異性,在腎癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要作用。對(duì)AIF的深入研究有助于探討腎癌惡性演進(jìn)過(guò)程的機(jī)制,為腎癌的治療提供潛在的靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11
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本文編號(hào)：1656976