發(fā)布時間：2018-03-19 16:29

  本文選題：尿exosomes　切入點：納米膜濃縮　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景2013年10月,諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎揭曉,美國2位科學(xué)家詹姆斯·羅斯曼(James E. Rothman)、蘭迪·謝克曼(Randy W.Schekman)和德國科學(xué)家托馬斯·蘇德霍夫(ThomasC.Sudhof)因“發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的主要運輸系統(tǒng)—囊泡運輸?shù)恼{(diào)節(jié)機制”,而榮獲2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。蘭迪·謝克曼發(fā)現(xiàn)了一系列與細胞囊泡運輸機制有關(guān)的基因;詹姆斯·羅斯曼發(fā)現(xiàn)了讓這些囊泡得以與其靶點相融合的蛋白質(zhì)機制,從而可以實現(xiàn)對所運“貨物”的傳遞;托馬斯·蘇德霍夫則揭示了信號是如何實現(xiàn)對囊泡的控制,使其得以精確分配其所載“貨物”。諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎獎項的授予,無疑將囊泡的研究推向了新的高潮。作為囊泡的一種,exosomes也受到越來越多的關(guān)注。1981年,Trams等在研究正常細胞和腫瘤細胞脫落小體的5'核苷酸外切酶的活性時,發(fā)現(xiàn)電鏡下存在很多直徑約40nm的囊泡,第一次發(fā)現(xiàn)了 exosomes。Exosomes是一種胞吞來源的、細胞分泌的粒徑約40～100nm大小的膜囊泡,其中含有蛋白、DNA、RNA和脂質(zhì)等。exosomes起源于內(nèi)吞的多囊體,由體內(nèi)各種細胞分泌。細胞經(jīng)過胞吞作用形成早期內(nèi)吞小體,早期內(nèi)吞小體以內(nèi)生出芽的方式形成多個內(nèi)生小囊泡,經(jīng)過內(nèi)吞分選轉(zhuǎn)運裝置的幫助,選擇性的接受胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)而形成晚期內(nèi)吞小體,即多囊體。多囊體或者與溶酶體融合而被降解,或者與質(zhì)膜融合,釋放其中的管內(nèi)囊泡,即exosomes,進入細胞間隙。Exosomes可以釋放進入血液,經(jīng)過血液循環(huán)而發(fā)揮作用,也可以進入局部微環(huán)境,介導(dǎo)細胞與細胞間相互作用。不同exosomes的功能是由其來源的細胞決定的。樹突狀細胞來源的exosomes參與免疫調(diào)節(jié)。病毒能夠劫持宿主細胞的exosomal裝置,逃避宿主的防御系統(tǒng),有助于病毒轉(zhuǎn)染。腫瘤來源的exosomes可以轉(zhuǎn)運蛋白、mRNA和miRNA,建立一個癌性裝置,有助于血管生成、細胞增生和細胞存活。Exosomes也出現(xiàn)在神經(jīng)組織退化性疾病的傳播中。尿exosomes由腎小管上皮細胞分泌,釋放進入尿液,可能攜帶有腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的生物標記物。研究發(fā)現(xiàn),尿exosomes中存在腎小球足細胞損傷的標記物如Podocine、podocalyxin和WT1;近曲小管損傷的標記物如megalin、cubilin、aminopeptidase N (APN)、水通道蛋白 1 (water channel aquaporin-1,AQP1)、Ⅳ型碳酸酐酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶;Henle袢升支粗段損傷的標記物如THP、CD9和2型Na-K-2C1轉(zhuǎn)運蛋白;遠曲小管損傷的標記物如Na-Cl cotransporter (NCC);集合管損傷的標記物如水通道蛋白2 (water channel aquaporin-2, AQP2)、mucin-1、Rh型C糖蛋白;膀胱移行上皮細胞損傷的標記物如uroplakin-1和uroplakin-2。因此,尿exosomes分析能夠為每一種泌尿系統(tǒng)上皮細胞的生理的和病理功能提供一個全新的認識。尿液作為一種無損傷的生物標記物來源,越來越受到人們的關(guān)注。2009年,第一個exosomes數(shù)據(jù)庫ExoCarta成立,收集了很多關(guān)于尿exosomes研究的數(shù)據(jù)。由于exosomes還是一個新興的研究領(lǐng)域,數(shù)據(jù)庫還在逐年逐步完善更新當中。2011 年,第一個國際細胞外囊泡協(xié)會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV, about Microvesicles, Exosomes, Ectosomes and other Extracelluar Vesicles)成立,這是exosomes研究史上的一個里程碑。近幾年,每年都有舉行關(guān)于尿exosomes研究的國際性學(xué)術(shù)交流會議。尿exosomes的研究已經(jīng)應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)疾病,如慢性腎臟病、膀胱癌和前列腺癌等,也有研究報道尿exosomes可用于急性心肌梗死和非小細胞肺癌診斷生物標記物的研究。眾所周知,尿液是泌尿系統(tǒng)及身體其他系統(tǒng)疾病檢測中的重要標本來源。然而,尿液中含量最多的是Tamm-Hosfall蛋白(Tamm-Hosfall Protein,THP),THP多聚體能夠包繞exosomes,給尿exosomes的提取帶來困難。目前,關(guān)于尿exosomes提取的技術(shù)各個實驗室都有自己的標準,但大部分實驗技術(shù)仍有待于進一步驗證,尚未發(fā)現(xiàn)有權(quán)威的統(tǒng)一的關(guān)于尿exosomes處理的標準化操作流程的研究報道。關(guān)于尿exosomes的提取技術(shù)一般有超速離心法和納米膜濃縮法,兩種方法各有各的優(yōu)點和不足。文獻報道的這兩種方法的工作流程大都很復(fù)雜,操作起來要花費大量的時間,而且需要配備一些特殊的儀器設(shè)備。我們的研究目的是探索尿exosomes的簡單有效提取技術(shù),為臨床研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。糖尿病是全球范圍的健康問題,特別是中國。國際糖尿病協(xié)會2012年第五版關(guān)于糖尿病流行病學(xué)資料表明,中國20～79歲糖尿病的患病人數(shù)有9230萬,排在世界第一位,其次是印度和美國。重要的是一半的糖尿病患者不知道自己患有糖尿病。還有一部分人雖然沒有達到糖尿病的診斷標準,但是空腹血糖受損,或者糖耐量異常,被稱為糖尿病前期(Prediabetes, PreDM)。糖尿病前期可能已經(jīng)有了并發(fā)癥,但是還沒有明顯的臨床表現(xiàn),或者患者并不知道。根據(jù)美國1999～2006年的統(tǒng)計,糖尿病前期慢性腎臟病的患病率已經(jīng)達到了 17.1%。因此,我們在已經(jīng)建立的尿exosomes納米膜濃縮法提取技術(shù)的基礎(chǔ)上,對糖尿病前期、糖尿病無蛋白尿期、糖尿病腎病微量白蛋白尿期和糖尿病腎病大量蛋白尿期的尿液進行exosomes的富集,與健康對照組進行比較,試圖尋找糖尿病前期和糖尿病腎病及其早期腎臟損害的生物標記物,從而為糖尿病腎病的早期診斷和干預(yù)提供依據(jù)。目的尋找糖尿病前期、糖尿病無蛋白尿期、糖尿病腎病微量白蛋白尿期和糖尿病腎病大量蛋白尿期尿exosomes中的生物標記物。方法1尿exosomes提取技術(shù)的優(yōu)化我們在國內(nèi)建立了兩種尿exosomes提取技術(shù):超速離心法和納米膜濃縮法。超速離心法的操作步驟是:首先室溫下相對離心力(RCF) 2000g離心30分鐘,去除細胞碎片、細菌及其他雜質(zhì)。其后,3.5kDa膜透析,三次更換超純水,冷室過夜。然后,真空濃縮樣品體積至原樣品體積的10%。接著室溫下RCF 18,000g離心30分鐘,去除尿液中的污染蛋白。最后,4℃C RCF 200,000g超速離心2小時,收集尿沉渣并用超純水重懸。納米膜濃縮法的操作步驟是:首先,室溫下RCF 2000g離心半個小時,去除細胞碎片、細菌及其他雜質(zhì)。其后,自制lOOOkDa納米膜濃縮裝置,檢查性能良好后,納米膜透析濃縮樣品至原體積的10%。待樣品濃縮至原體積的10%左右時,加入200ml超純水,反復(fù)沖洗納米膜,濾過尿液中的可溶性蛋白和黃色微粒。待樣品進一步透析濃縮至4～5ml時收集濃縮液。最后,4℃RCF40,000g離心1小時,收集尿沉渣并用超純水重懸。2尿液exosome標本收集方法的優(yōu)化留取健康志愿者的晨尿標本,分為15ml組和50ml組,15ml尿液標本又分為添加蛋白酶抑制劑組和不添加蛋白酶抑制劑組,50ml尿液標本又分為添加蛋白酶抑制劑組和不添加蛋白酶抑制劑組,每組各8例。納米膜濃縮法提取尿exosomes,Bradford考馬斯亮藍法測定尿exosomes的蛋白濃度,比較各組間蛋白濃度的差異。3糖尿病及糖尿病腎病不同階段晨尿標本的處理從珠海流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)庫中隨機篩選出正常對照組、糖尿病前期、糖尿病無蛋白尿期、糖尿病腎病微量白蛋白尿期和糖尿病腎病大量蛋白尿期共75例社區(qū)居民納入我們的蛋白組學(xué)研究,每組各15例。收集晨尿50～100ml,納米膜濃縮技術(shù)提取尿exosomes。4尿exosomes的鑒定Bradford考馬斯亮藍法測蛋白濃度。透射電鏡觀察尿exosomes的形態(tài)分布,納米顆粒跟蹤分析軟件觀察尿exosomes的布朗運動,形態(tài),粒徑和強度。凝膠考馬斯亮藍染色觀察疾病不同組的蛋白條帶分布。Western blot檢測尿exosomes的生成標記物TSG101。5蛋白組學(xué)研究技術(shù)在糖尿病腎病研究中的應(yīng)用利用熒光差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù)分離蛋白質(zhì),掃描分析建立圖譜,通過DeCyder 2D差異分析軟件,分析尋找差異蛋白。挖取與正常對照組相比較,在糖尿病前期、糖尿病無蛋白尿期、糖尿病腎病微量白蛋白尿期和糖尿病腎病大量蛋白尿期具有差異表達1.5倍以上的蛋白質(zhì),膠內(nèi)酶解,進行輔助激光解析離子化-飛行時飛行時間/飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)鑒定,數(shù)據(jù)庫檢索,獲得這些蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)和功能信息,結(jié)合文獻,對感興趣蛋白行生物信息學(xué)分析。6統(tǒng)計學(xué)分析SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,USA)統(tǒng)計學(xué)軟件被用來做統(tǒng)計分析。15ml和50ml添加蛋白酶抑制劑和不添加蛋白酶抑制劑所測得蛋白濃度用均值±標準差表示(μg/ml),采用析因設(shè)計方差分析對所得數(shù)據(jù)進行方差分析。對所納入研究人群的性別、年齡、血糖、尿微量白蛋白/肌酐比值、血肌酐和尿素氮所得數(shù)據(jù),方差齊時采用LSD法進行方差分析,方差不齊時,采用Welch方法,選擇Dunnett's T3法進行兩兩比較,計量資料同樣采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較各組間的差異,計數(shù)資料采用χ2檢驗。P0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.與超速離心法相比較,納米膜濃縮技術(shù)提取尿exosomes的操作步驟,具有以下優(yōu)點:離心次數(shù)少,透析除雜簡單,濃縮樣品快,節(jié)約流程時間,普通實驗室可操作,可一次性處理大量樣品。2.添加和不添加蛋白酶抑制劑對尿exosomes的提取影響不大,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.828,P0.001)。50ml尿提取的exosomes蛋白定量顯著高于15ml,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=58.661, P0.001)。所納入研究對象的疾病不同階段的人群空腹血糖(F=28.950, P0.001)、尿微量白蛋白尿/肌酐比值(F= 161.456, P=0.000)、血肌酐(F=3. 111,P0.05 )、尿素氮(F=5.612, P0.05 )、年齡(F=11.950,P0.001),男性(χ2=32.000, P0.001),女性(χ2=43.000,P0.001),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.透射電鏡下尿exosomes呈杯狀或者橢圓形,分布均勻,粒徑大約30～100nm。納米顆粒跟蹤分析軟件分析表明,exosomes呈杯狀或者橢圓形,分部均勻,布朗運動活躍,exosomes平均粒徑55～llOnm。Bradford考馬斯亮藍法測蛋白濃度發(fā)現(xiàn):正常對照組為15.4μg/ml,糖尿病前期為26.56μg/ml,糖尿病無蛋白尿期為51.55μμg/ml,糖尿病腎病微量白蛋白尿期為76.62μg/ml,糖尿病腎病大量蛋白尿期為89.14μg/ml。凝膠考馬斯亮藍染色顯示exosomes蛋白條帶顯著,Western blot檢測到exosomes的生成標記物TSG101陽性。4. 2D-DIGE蛋白組學(xué)和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,共鑒定出22個差異蛋白,生物信息學(xué)分析表明,涉及到蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有催化活性、結(jié)合活性、結(jié)構(gòu)活性、酶調(diào)節(jié)活性、mRNA處理活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性,其涉及的生物學(xué)程序有殺傷功能、慢性炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、信號通路、發(fā)育功能、細胞外基質(zhì)的生成功能、造血功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、分化功能、轉(zhuǎn)運功能、代謝功能。通過蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析和文獻檢索,共篩選出4個感興趣的差異蛋白:甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸肽酶2 (MASP2)、鈣結(jié)合蛋白D28k (CALB1)、鈣結(jié)合蛋白S100A8 (Protein S100 A8)和鈣結(jié)合蛋白S100A9 ( ProteinS 100 A9)。結(jié)論1.本研究確定了納米膜濃縮技術(shù)提取尿exosomes的操作步驟在尿exosomes蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用。2. 50ml晨尿添加或不添加蛋白酶抑制劑均適合于尿exosomes的蛋白組學(xué)分析。3.糖尿病在疾病的不同時期分泌的exosomes量是不同的,隨著疾病的進展,exosomes的分泌量逐漸增加,exosomes涉及疾病的發(fā)病機制和過程。4. MASP2、CALB1、Protein S100 A8 和 Protein S100 A9 可能涉及糖尿病及糖尿病腎病不同時期的轉(zhuǎn)變,是糖尿病疾病進展的潛在生物標記物。創(chuàng)新點經(jīng)國內(nèi)外文獻檢索,尚未發(fā)現(xiàn)利用DIGE和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)對糖尿病及糖尿病腎病不同階段晨尿exosomes進行蛋白組學(xué)分析的研究報道。本研究所納入的研究對象來自于橫斷面流行病學(xué)調(diào)查的社區(qū)居民,研究結(jié)果更加具有科學(xué)性。利用DIGE技術(shù)分離尋找差異蛋白,重復(fù)性和敏感性更好。第一次報道糖尿病及糖尿病腎病不同階段尿exosomes中MASP2、CALB1、Protein S100 A8和Protein S100A9蛋白表達明顯異常。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692.9

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