本文選題：急性腎損傷　切入點(diǎn)：microRNA　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及目的急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是臨床非常常見,花費(fèi)極高且造成住院病人死亡率明顯增加的危重癥[1],其發(fā)病率約為2‰[2]�；颊叩念A(yù)后直接取決于AKI的嚴(yán)重程度,甚至是極輕微的血清肌酐水平變化也不可忽視[3]。近年研究表明發(fā)生AKI后,損傷最早出現(xiàn)在近端腎小管上皮細(xì)胞,并表現(xiàn)為各種形式的細(xì)胞死亡,而腎臟功能的恢復(fù)則依賴于那些存活下來的腎小管上皮細(xì)胞,通過去分化及增殖以重建腎單位[4,5]。因此增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞對損傷的抵抗力,提高其存活率,即為有益于損傷后的修復(fù)進(jìn)程,亦對治療和預(yù)后有著不可小覷的意義。近年來,雖然對近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的定義及分類已有較為明確的結(jié)論,但損傷后誘發(fā)其凋亡的使動因素及相關(guān)機(jī)制尚不清楚,而探尋上游基因水平調(diào)控機(jī)制對于治療甚至于預(yù)防AKI都有非凡的臨床價(jià)值。MicroRNAs(miRNAs)是一類具有基因表達(dá)調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因mRNA的翻譯過程及其在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性從而抑制靶基因表達(dá)[6-10](圖1)。至少有1000個(gè)miRNAs經(jīng)生物信息學(xué)分析參與人體幾乎所有細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控,其表達(dá)水平的改變與很多疾病的病理過程密切相關(guān)[11-15]。在眾多miRNAs中,miRNA17簇(miRNA17 cluster,miR17~92)是研究最為廣泛的一組miRNAs。miR17~92的缺失不僅發(fā)現(xiàn)直接影響動物肺部及心血管系統(tǒng)的發(fā)育,還對損傷后病理及修復(fù)過程的調(diào)控至關(guān)重要[16-20]。近期腎臟方面的研究證實(shí)miR17~92的缺陷使得小鼠腎臟細(xì)胞增殖受到抑制,腎單位數(shù)量減少,6周齡即出現(xiàn)蛋白尿,3月齡出現(xiàn)腎小球硬化[21]。同時(shí)miRNAs在AKI中的作用也逐漸成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn),美國喬治亞攝政大學(xué)(前喬治亞州醫(yī)學(xué)院)首次使用Dicer(miRNA生物合成的關(guān)鍵酶)近端腎小管細(xì)胞特異性敲除鼠證實(shí),在腎臟缺血再灌注損傷(Renal Ischemia Reperfusion Injury,IRI)動物模型中總體miRNAs耗竭減緩了缺血性損傷[22]。而令人振奮的是隨后有研究者發(fā)現(xiàn)miR-17~92中最主要的mi RNA,即miR-17主鏈(miR-17-5p)在IRI后的修復(fù)階段被激活[23],但并未深入研究這一活化對于腎小管上皮細(xì)胞的抗凋亡能力及腎臟的再生修復(fù)是否有利,以及其作用機(jī)制如何尚不清楚。本課題的目的是觀察miR-17-5p在急性腎損傷中的作用及對近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響,并進(jìn)一步探討miR-17-5p上下游信號通路的調(diào)控作用,為AKI的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法1、aki體內(nèi)、體外模型及mir-17-5p的表達(dá):(1)體內(nèi)動物模型:8-12周齡雄性c57bl/6小鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注損傷無修復(fù)模型組、缺血再灌注損傷伴修復(fù)模型組。缺血再灌注損傷無修復(fù)模型組小鼠給予雙側(cè)腎動脈夾閉缺血30分鐘松夾再灌注手術(shù)處理,分別于急性損傷期即再灌注12小時(shí)(i30r12h)和損傷晚期即再灌注48小時(shí)(i30r48h)處死動物,留取腎皮質(zhì)組織并提取組織總rna。缺血再灌注損傷伴修復(fù)模型組小鼠給予雙側(cè)腎動脈夾閉缺血25分鐘松夾再灌注手術(shù)處理,分別于各個(gè)修復(fù)期即再灌注1天(i25r1d)、3天(i25r3d)、5天(i25r5d)、7天(i25r7d)處死動物,留取腎皮質(zhì)組織并提取組織總rna。對標(biāo)本進(jìn)行real-timepcr檢測并分析mir-17-5p在急性腎損傷不同階段的表達(dá)變化。(2)體外細(xì)胞模型:培養(yǎng)近端腎小管上皮細(xì)胞系rptc。采用物理性缺氧模型(hypoxia)及化學(xué)性缺氧模型(疊氮化鈉,sodiumazide)。hypoxia模型組,給予1%氧培養(yǎng)細(xì)胞,分別于0小時(shí)(0h)、6小時(shí)(6h)、12小時(shí)(12h)、24小時(shí)(24h)、36小時(shí)(36h)、48小時(shí)(48h)收集細(xì)胞提取細(xì)胞總rna。sodiumazide模型組,給予1mol/lsodiumazide培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液復(fù)氧處理,分別于復(fù)氧1小時(shí)(1h)、2小時(shí)(2h)、3小時(shí)(3h)收集細(xì)胞提取細(xì)胞總rna。對標(biāo)本進(jìn)行real-timepcr檢測并分析mir-17-5p在aki不同體外模型中的表達(dá)變化。2、mir-17-5p生物學(xué)功能體外實(shí)驗(yàn):采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染mir-17-5p寡核苷酸抑制探針(anti-mir-17-5p-lna)或內(nèi)源性mir-17-5p模擬物(mir-17-5pmimic)入rptc細(xì)胞,制備體外缺氧模型,分別采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡率,并收集細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白,采用immunoblotting技術(shù)分析凋亡標(biāo)志物caspase-3裂解。3、下游機(jī)制研究:通過生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測mir-17-5p下游靶基因,初步選定多個(gè)數(shù)據(jù)庫一致且存在多個(gè)物種保守序列的靶基因死亡受體6(deathrceptor6,dr6)進(jìn)行下一步體內(nèi)、體外驗(yàn)證:雄性c57bl/6小鼠給予雙側(cè)腎動脈夾閉25分鐘,再灌注1d,3d,5d,7d,留取腎臟皮質(zhì)提取總蛋白,采用immunoblotting分析dr6變化。構(gòu)建含有mir-17-5p綁定序列的dr63’utr熒光素酶表達(dá)載體,并與mir-17-5pmimic或無效序列(scrambledsequenceoligonucleotide)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測熒光素酶活性變化;進(jìn)一步構(gòu)建dr6基因下調(diào)rptc細(xì)胞系制備缺氧模型,收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白采用immunoblotting檢測dr6變化,并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡率。4、上游機(jī)制研究:通過生物信息學(xué)分析預(yù)測mir-17-5p上游可能的調(diào)控機(jī)制,初步分析獲得轉(zhuǎn)錄因子p53與mir-17-5p宿主基因的可能調(diào)控位點(diǎn),并采用染色質(zhì)免疫共沉淀法(Ch IP)證實(shí)其綁定調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步進(jìn)行體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。(1)體外實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)RPTC細(xì)胞,給予特異性p53通路抑制劑(pifithrin-α)干預(yù)后制備缺氧模型,采用Real-time PCR分析miR-17-5p表達(dá)的變化。構(gòu)建顯性失活突變體p53(Dominant-negative p53,DN-P53)過表達(dá)RPTC細(xì)胞系,制備缺氧模型后Immunoblotting分析p53及DN-P53變化,Real-time PCR分析miR-17-5p表達(dá)變化。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):繁育并鑒定腎臟近端腎小管p53野生型(PT-P53-WT)和敲除型小鼠(PT-P53-KO),給予雙側(cè)腎動脈夾閉30分鐘松夾再灌注48小時(shí)(I30R48h)處理,留取小鼠血標(biāo)本測尿素氮(BUN)、血肌酐(sCr),提取腎臟皮質(zhì)蛋白及RNA,immunoblotting檢測p53變化,Real-time PCR分析miR-17-5p表達(dá)變化。研究結(jié)果1、miR-17-5p在急性腎損傷非修復(fù)動物模型損傷晚期表達(dá)明顯上調(diào),在急性腎損傷伴修復(fù)動物模型各個(gè)時(shí)期均有上調(diào),體外模型中,miR-17-5p于缺氧6小時(shí)出現(xiàn)微弱上調(diào),24小時(shí)上調(diào)最明顯;而化學(xué)性缺氧不能誘發(fā)miR-17-5p表達(dá)上調(diào)。2、miR-17-5p表達(dá)上調(diào)可以明顯抑制缺氧誘發(fā)的RPTC細(xì)胞凋亡,而外源性抑制miR-17-5p的表達(dá)則使RPTC細(xì)胞對缺氧刺激耐受下降,凋亡增加。3、小鼠腎臟缺血25分鐘再灌注1天后,DR6在腎臟皮質(zhì)組織中的表達(dá)即明顯減少,并且持續(xù)一周。內(nèi)源性miR-17-5p模擬物可以顯著抑制RPTC細(xì)胞中DR6的表達(dá),相反miR-17-5p寡核苷酸抑制探針則解除miR-17-5p對DR6的抑制作用。通過構(gòu)建含miR-17-5p在DR6 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)綁定序列的熒光素酶表達(dá)載體證實(shí)DR6為miR-17-5p下游直接靶基因。而DR6基因下調(diào)的RPTC也對缺氧的耐受增強(qiáng),凋亡明顯減少。4、miR-17-5p兩個(gè)宿主基因miR-17-1及miR-17-2啟動子區(qū)均存在p53調(diào)控位點(diǎn),通過染色質(zhì)免疫共沉淀法證實(shí)在缺氧條件下p53通過其調(diào)控序列誘導(dǎo)miR-17-5p表達(dá)。P53通路抑制劑可以顯著抑制p53表達(dá),從而抑制miR-17-5p在缺氧條件下的上調(diào)。同時(shí),過表達(dá)抑制p53基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的顯性失活突變體RPTC細(xì)胞中,缺氧條件不能誘發(fā)miR-17-5p表達(dá)上調(diào)。P53近端腎小管上皮細(xì)胞條件性敲除的小鼠,經(jīng)缺血30分鐘再灌注48小時(shí)后,miR-17-5p在腎臟皮質(zhì)中的表達(dá)明顯減少。但小鼠腎功能并未惡化,反而有所改善。結(jié)論本課題經(jīng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探索發(fā)現(xiàn)了在急性腎損傷中大量表達(dá)且具有腎小管上皮細(xì)胞保護(hù)作用的miR-17-5p,其上調(diào)依賴于p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控,并且通過抑制下游靶基因DR6實(shí)現(xiàn)抗凋亡等腎臟保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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本文編號：1632024