本文選題：急性腎損傷　切入點：microRNA　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景及目的急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是臨床非常常見,花費極高且造成住院病人死亡率明顯增加的危重癥[1],其發(fā)病率約為2‰[2]�；颊叩念A后直接取決于AKI的嚴重程度,甚至是極輕微的血清肌酐水平變化也不可忽視[3]。近年研究表明發(fā)生AKI后,損傷最早出現(xiàn)在近端腎小管上皮細胞,并表現(xiàn)為各種形式的細胞死亡,而腎臟功能的恢復則依賴于那些存活下來的腎小管上皮細胞,通過去分化及增殖以重建腎單位[4,5]。因此增強腎小管上皮細胞對損傷的抵抗力,提高其存活率,即為有益于損傷后的修復進程,亦對治療和預后有著不可小覷的意義。近年來,雖然對近端腎小管上皮細胞凋亡的定義及分類已有較為明確的結論,但損傷后誘發(fā)其凋亡的使動因素及相關機制尚不清楚,而探尋上游基因水平調控機制對于治療甚至于預防AKI都有非凡的臨床價值。MicroRNAs(miRNAs)是一類具有基因表達調控功能的非編碼小分子RNA,通過轉錄后調控靶基因mRNA的翻譯過程及其在胞質中的穩(wěn)定性從而抑制靶基因表達[6-10](圖1)。至少有1000個miRNAs經(jīng)生物信息學分析參與人體幾乎所有細胞進程的調控,其表達水平的改變與很多疾病的病理過程密切相關[11-15]。在眾多miRNAs中,miRNA17簇(miRNA17 cluster,miR17~92)是研究最為廣泛的一組miRNAs。miR17~92的缺失不僅發(fā)現(xiàn)直接影響動物肺部及心血管系統(tǒng)的發(fā)育,還對損傷后病理及修復過程的調控至關重要[16-20]。近期腎臟方面的研究證實miR17~92的缺陷使得小鼠腎臟細胞增殖受到抑制,腎單位數(shù)量減少,6周齡即出現(xiàn)蛋白尿,3月齡出現(xiàn)腎小球硬化[21]。同時miRNAs在AKI中的作用也逐漸成為研究者關注的焦點,美國喬治亞攝政大學(前喬治亞州醫(yī)學院)首次使用Dicer(miRNA生物合成的關鍵酶)近端腎小管細胞特異性敲除鼠證實,在腎臟缺血再灌注損傷(Renal Ischemia Reperfusion Injury,IRI)動物模型中總體miRNAs耗竭減緩了缺血性損傷[22]。而令人振奮的是隨后有研究者發(fā)現(xiàn)miR-17~92中最主要的mi RNA,即miR-17主鏈(miR-17-5p)在IRI后的修復階段被激活[23],但并未深入研究這一活化對于腎小管上皮細胞的抗凋亡能力及腎臟的再生修復是否有利,以及其作用機制如何尚不清楚。本課題的目的是觀察miR-17-5p在急性腎損傷中的作用及對近端腎小管上皮細胞凋亡的影響,并進一步探討miR-17-5p上下游信號通路的調控作用,為AKI的治療提供新的思路和實驗依據(jù)。研究方法1、aki體內、體外模型及mir-17-5p的表達:(1)體內動物模型:8-12周齡雄性c57bl/6小鼠,隨機分為假手術組(sham)、缺血再灌注損傷無修復模型組、缺血再灌注損傷伴修復模型組。缺血再灌注損傷無修復模型組小鼠給予雙側腎動脈夾閉缺血30分鐘松夾再灌注手術處理,分別于急性損傷期即再灌注12小時(i30r12h)和損傷晚期即再灌注48小時(i30r48h)處死動物,留取腎皮質組織并提取組織總rna。缺血再灌注損傷伴修復模型組小鼠給予雙側腎動脈夾閉缺血25分鐘松夾再灌注手術處理,分別于各個修復期即再灌注1天(i25r1d)、3天(i25r3d)、5天(i25r5d)、7天(i25r7d)處死動物,留取腎皮質組織并提取組織總rna。對標本進行real-timepcr檢測并分析mir-17-5p在急性腎損傷不同階段的表達變化。(2)體外細胞模型:培養(yǎng)近端腎小管上皮細胞系rptc。采用物理性缺氧模型(hypoxia)及化學性缺氧模型(疊氮化鈉,sodiumazide)。hypoxia模型組,給予1%氧培養(yǎng)細胞,分別于0小時(0h)、6小時(6h)、12小時(12h)、24小時(24h)、36小時(36h)、48小時(48h)收集細胞提取細胞總rna。sodiumazide模型組,給予1mol/lsodiumazide培養(yǎng)細胞3小時后更換新鮮培養(yǎng)液復氧處理,分別于復氧1小時(1h)、2小時(2h)、3小時(3h)收集細胞提取細胞總rna。對標本進行real-timepcr檢測并分析mir-17-5p在aki不同體外模型中的表達變化。2、mir-17-5p生物學功能體外實驗:采用脂質體法轉染mir-17-5p寡核苷酸抑制探針(anti-mir-17-5p-lna)或內源性mir-17-5p模擬物(mir-17-5pmimic)入rptc細胞,制備體外缺氧模型,分別采用細胞形態(tài)學分析及hoechst染色法觀察細胞凋亡率,并收集細胞提取細胞蛋白,采用immunoblotting技術分析凋亡標志物caspase-3裂解。3、下游機制研究:通過生物信息數(shù)據(jù)庫預測mir-17-5p下游靶基因,初步選定多個數(shù)據(jù)庫一致且存在多個物種保守序列的靶基因死亡受體6(deathrceptor6,dr6)進行下一步體內、體外驗證:雄性c57bl/6小鼠給予雙側腎動脈夾閉25分鐘,再灌注1d,3d,5d,7d,留取腎臟皮質提取總蛋白,采用immunoblotting分析dr6變化。構建含有mir-17-5p綁定序列的dr63’utr熒光素酶表達載體,并與mir-17-5pmimic或無效序列(scrambledsequenceoligonucleotide)共轉染細胞,檢測熒光素酶活性變化;進一步構建dr6基因下調rptc細胞系制備缺氧模型,收集細胞提取細胞總蛋白采用immunoblotting檢測dr6變化,并進行細胞形態(tài)學分析及hoechst染色法觀察細胞凋亡率。4、上游機制研究:通過生物信息學分析預測mir-17-5p上游可能的調控機制,初步分析獲得轉錄因子p53與mir-17-5p宿主基因的可能調控位點,并采用染色質免疫共沉淀法(Ch IP)證實其綁定調控關系。進一步進行體外、體內實驗驗證。(1)體外實驗:培養(yǎng)RPTC細胞,給予特異性p53通路抑制劑(pifithrin-α)干預后制備缺氧模型,采用Real-time PCR分析miR-17-5p表達的變化。構建顯性失活突變體p53(Dominant-negative p53,DN-P53)過表達RPTC細胞系,制備缺氧模型后Immunoblotting分析p53及DN-P53變化,Real-time PCR分析miR-17-5p表達變化。(2)體內實驗:繁育并鑒定腎臟近端腎小管p53野生型(PT-P53-WT)和敲除型小鼠(PT-P53-KO),給予雙側腎動脈夾閉30分鐘松夾再灌注48小時(I30R48h)處理,留取小鼠血標本測尿素氮(BUN)、血肌酐(sCr),提取腎臟皮質蛋白及RNA,immunoblotting檢測p53變化,Real-time PCR分析miR-17-5p表達變化。研究結果1、miR-17-5p在急性腎損傷非修復動物模型損傷晚期表達明顯上調,在急性腎損傷伴修復動物模型各個時期均有上調,體外模型中,miR-17-5p于缺氧6小時出現(xiàn)微弱上調,24小時上調最明顯;而化學性缺氧不能誘發(fā)miR-17-5p表達上調。2、miR-17-5p表達上調可以明顯抑制缺氧誘發(fā)的RPTC細胞凋亡,而外源性抑制miR-17-5p的表達則使RPTC細胞對缺氧刺激耐受下降,凋亡增加。3、小鼠腎臟缺血25分鐘再灌注1天后,DR6在腎臟皮質組織中的表達即明顯減少,并且持續(xù)一周。內源性miR-17-5p模擬物可以顯著抑制RPTC細胞中DR6的表達,相反miR-17-5p寡核苷酸抑制探針則解除miR-17-5p對DR6的抑制作用。通過構建含miR-17-5p在DR6 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)綁定序列的熒光素酶表達載體證實DR6為miR-17-5p下游直接靶基因。而DR6基因下調的RPTC也對缺氧的耐受增強,凋亡明顯減少。4、miR-17-5p兩個宿主基因miR-17-1及miR-17-2啟動子區(qū)均存在p53調控位點,通過染色質免疫共沉淀法證實在缺氧條件下p53通過其調控序列誘導miR-17-5p表達。P53通路抑制劑可以顯著抑制p53表達,從而抑制miR-17-5p在缺氧條件下的上調。同時,過表達抑制p53基因轉錄調控活性的顯性失活突變體RPTC細胞中,缺氧條件不能誘發(fā)miR-17-5p表達上調。P53近端腎小管上皮細胞條件性敲除的小鼠,經(jīng)缺血30分鐘再灌注48小時后,miR-17-5p在腎臟皮質中的表達明顯減少。但小鼠腎功能并未惡化,反而有所改善。結論本課題經(jīng)體內和體外實驗探索發(fā)現(xiàn)了在急性腎損傷中大量表達且具有腎小管上皮細胞保護作用的miR-17-5p,其上調依賴于p53轉錄調控,并且通過抑制下游靶基因DR6實現(xiàn)抗凋亡等腎臟保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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本文編號：1632024