本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：環(huán)指蛋白2　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:組蛋白的翻譯后修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要內(nèi)容,已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色。環(huán)指蛋白2(ring finger protein 2,RNF2)是多梳蛋白抑制性復(fù)合物1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的催化亞單位,可介導(dǎo)組蛋白H2A(histone 2A,H2A)的單泛素化修飾。研究表明,RNF2在多種腫瘤中呈特異性高表達(dá),且具有促腫瘤效應(yīng)。但是RNF2在前列腺癌(prostate cancer,PCa)中的研究還鮮有報(bào)導(dǎo)。在本研究中,我們首先通過(guò)對(duì)PCa組織和良性前列腺增生組織(benign prostatic hyperplasia,BPH)中RNF2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),以明確RNF2在PCa中的表達(dá)水平。隨后,通過(guò)在PCa細(xì)胞系中特異性下調(diào)RNF2的表達(dá),檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞活力的變化,以明確RNF2在PCa中的生物學(xué)功能。進(jìn)一步,我們通過(guò)尋找差異性表達(dá)基因,篩選、驗(yàn)證受RNF2調(diào)控的下游靶基因并探索其相關(guān)的分子機(jī)制。方法:1.利用免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry,IHC)對(duì)含有PCa(n=81)和BPH(n=71)的組織芯片(tissue microarray,TMA)進(jìn)行RNF2的染色并利用H-Score評(píng)分系統(tǒng)對(duì)RNF2的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分,對(duì)PCa組織和BPH組織中RNF2的表達(dá)進(jìn)行差異性分析,并對(duì)PCa組織中RNF2的表達(dá)水平與腫瘤的Gleason評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。2.設(shè)計(jì)并合成靶向RNF2的特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNF2#1和siRNF2#2)以及陰性對(duì)照siRNA(siNC)。將它們轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP細(xì)胞并利用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和蛋白電泳(western blot,WB)對(duì)下調(diào)效果分別在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。利用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)對(duì)各處理組細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。利用噻唑藍(lán)比色法(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide assay,MTT assay)檢測(cè)各處理組細(xì)胞的活力。3.設(shè)計(jì)并合成靶向RNF2的特異性短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)(shRNF2#1和shRNF2#2)及對(duì)照shRNA(shScr),構(gòu)建帶綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的shRNA慢病毒表達(dá)載體。將慢病毒包裝載體及shRNA表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝,所得慢病毒分別命名為shRNF2#1、shRNF2#2和shScr。所得慢病毒分別感染DU145和LNCaP細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察感染效率。利用RT-qPCR和WB檢測(cè)RNF2的下調(diào)效果,利用FCM和MTT檢測(cè)各處理組細(xì)胞的周期、凋亡和細(xì)胞活力變化。4.將shRNF2#1、shRNF2#2和shScr感染后的DU145細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),以5×106個(gè)細(xì)胞分別接種于裸鼠背外側(cè)近右側(cè)大腿處,觀察各處理組移植瘤的生長(zhǎng)情況,繪制生長(zhǎng)曲線。觀察結(jié)束后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施安樂死,對(duì)腫瘤組織進(jìn)行固定、包埋和切片。利用IHC對(duì)各處理組腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3,cleaved-casp3)進(jìn)行染色,以評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖和凋亡情況。5.siRNF2#1、siRNF2#2和siNC分別轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞,72小時(shí)后提取各處理組細(xì)胞總RNA并送上海伯豪生物技術(shù)公司進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜檢測(cè),尋找RNF2下調(diào)組細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞的差異性表達(dá)基因,并利用GeneOntology、BioCarta-ATCG等在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異性表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)分析。利用RT-qPCR和WB進(jìn)行驗(yàn)證,尋找RNF2的潛在功能性下游靶基因。對(duì)方法4中所得各處理組移植瘤組織進(jìn)行RNF2和相應(yīng)靶基因的IHC染色,驗(yàn)證二者的相關(guān)性。6.針對(duì)前期實(shí)驗(yàn)篩選出的RNF2潛在下游靶基因硫氧還蛋白結(jié)合蛋白基因(thioredoxin interacting protein,TXNIP)設(shè)計(jì)合成特異性siRNA和shRNA,構(gòu)建shRNA的慢病毒表達(dá)載體并進(jìn)行慢病毒包裝,分別命名為siTXNIP和shTXNIP。利用siTXNIP和shTXNIP對(duì)RNF2下調(diào)細(xì)胞進(jìn)行功能學(xué)挽救實(shí)驗(yàn)。siRNA實(shí)驗(yàn)分組為:siRNF2#1、siTXNIP、si RNF2#1+siTXNIP和siNC;shRNA實(shí)驗(yàn)分組為:shRNF2#1、shTXNIP、shRNF2#1+shTXNIP和shScr。利用RT-qPCR和WB檢測(cè)各處理組細(xì)胞RNF2和TXNIP的表達(dá)水平,利用FCM和MTT檢測(cè)細(xì)胞的周期、凋亡和細(xì)胞活力的變化。7.針對(duì)TXINP基因啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)特異性PCR引物,利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)檢測(cè)TXNIP啟動(dòng)子區(qū)RNF2的富集和組蛋白H2AK119Ub的水平。利用siRNA特異性下調(diào)RNF2的表達(dá)后,檢測(cè)RNF2和H2AK119Ub在TXNIP啟動(dòng)子區(qū)的富集和水平變化。結(jié)果:1.對(duì)TMA的IHC染色和H-Score評(píng)分結(jié)果顯示,PCa組織中RNF2的表達(dá)水平(H-Score:117.53±62.34)明顯高于BPH組織(H-Score:90.14±63.66)。PCa組織中,RNF2的表達(dá)水平與Gleason評(píng)分的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,Gleason評(píng)分高(Gleason評(píng)分7)的PCa組織中RNF2的表達(dá)水平(H-Score:150.50±62.03)明顯高于Gleason評(píng)分低(Gleason評(píng)分≤6)的PCa組織(H-Score:97.10±53.63)。2.RT-qPCR和WB結(jié)果顯示,siRNF2#1和siRNF2#2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下調(diào)RNF2的表達(dá)。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組細(xì)胞相對(duì),RNF2下調(diào)組DU145和LNCaP的G1期細(xì)胞和凋亡細(xì)胞顯著增加。MTT結(jié)果提示,RNF2下調(diào)組細(xì)胞的活力較正常對(duì)照組顯著降低。3.成功包裝能特異性下調(diào)RNF2的慢病毒顆粒并能有效感染目的細(xì)胞。RT-qPCR和WB結(jié)果顯示,shRNF2#1和shRNF2#2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下調(diào)RNF2的表達(dá)。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRNF2#1和shRNF2#2可誘導(dǎo)DU145和LNCaP細(xì)胞的G1期阻滯、凋亡增加和細(xì)胞活力下降。4.成功建立了shScr、shRNF2#1和shRNF2#2慢病毒感染后的DU145細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。結(jié)果顯示,shScr、shRNF2#1和shRNF2#2處理組移植瘤在觀察終點(diǎn)的體積分別為846.80±55.29 mm3、304.33±63.72 mm3和331.93±84.42 mm3。腫瘤生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組移植瘤的生長(zhǎng)速度顯著低于對(duì)照組。IHC染色結(jié)果顯示,與shScr處理組相比,shRNF2#1和shRNF2#2處理組腫瘤組織中PCNA的表達(dá)水平明顯降低,而cleaved-casp3的水平顯著增加。5.對(duì)數(shù)字基因表達(dá)譜結(jié)果的分析顯示,特異性下調(diào)RNF2所導(dǎo)致的≥1.5倍的差異化表達(dá)基因達(dá)632個(gè),其中144個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。利用Gene Ontlogy和BioCarta-TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)的GO分析結(jié)果顯示,大量差異性表達(dá)基因參與細(xì)胞周期、有絲分裂、增殖和凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控�；赑cGs的轉(zhuǎn)錄抑制功能考慮,我們重點(diǎn)對(duì)表達(dá)顯著上調(diào)的基因進(jìn)行了分析、篩選并利用RT-qPCR和WB進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,與細(xì)胞增殖、凋亡和周期調(diào)控密切相關(guān)的TXNIP是RNF2潛在的重要功能性下游靶基因。對(duì)DU145細(xì)胞裸鼠移植瘤組織的IHC染色結(jié)果顯示,RNF2下調(diào)組的腫瘤組織中TXNIP的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組腫瘤組織。6.RT-qPCR和WB結(jié)果顯示,siTXNIP和shTXNIP均能有效下調(diào)TXNIP的mRNA水平和蛋白水平。FCM結(jié)果顯示,通過(guò)siRNA或shRNA同時(shí)下調(diào)RNF2和TXNIP可有效挽救單獨(dú)下調(diào)RNF2所導(dǎo)致的DU145和LNCaP細(xì)胞凋亡增加和G1期阻滯。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同時(shí)下調(diào)RNF2和TXNIP可有效挽救單獨(dú)下調(diào)RNF2所導(dǎo)致的DU145和LNCaP細(xì)胞活力降低。7.Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RNF2可直接結(jié)合于TXNIP的啟動(dòng)子區(qū)并促進(jìn)組蛋白H2AK119的單泛素化。利用siRNA特異性下調(diào)RNF2的表達(dá)后,RNF2的富集和H2AK119Ub的水平均顯著降低。結(jié)論:1.RNF2在PCa中的表達(dá)水平顯著高于BPH,且其表達(dá)水平與腫瘤的Gleason評(píng)分呈正相關(guān),RNF2在PCa的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有促腫瘤效應(yīng)。2.RNF2對(duì)PCa細(xì)胞的周期、凋亡和細(xì)胞活力有重要的調(diào)控作用,下調(diào)RNF2可誘導(dǎo)PCa細(xì)胞發(fā)生周期阻滯,凋亡增加和細(xì)胞活力下降,并可顯著抑制PCa裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。3.RNF2下調(diào)可誘導(dǎo)大量下游靶基因的表達(dá)變化,其中TXNIP是其中一種功能性下游靶基因,RNF2的生物學(xué)功能部分依賴于它對(duì)TXNIP的表達(dá)調(diào)控。4.RNF2可直接結(jié)合于TXNIP的啟動(dòng)子區(qū),并促進(jìn)組蛋白H2AK119的單泛素化從而調(diào)控TNXIP的轉(zhuǎn)錄。5.RNF2是PCa潛在的生物標(biāo)志分子和治療靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25
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本文編號(hào)：1622586