本文選題：Cdc6　切入點：ATR　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤,世界范圍內(nèi),膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位[1]。以順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum, CDDP)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在晚期膀胱癌的治療中占有重要地位,目前一線的化療方案包括GC(吉西他濱+順鉑)、MAVC(甲氨蝶呤+阿霉素+長春新堿+順鉑)[2]�；熌軌蛞欢ǔ潭壬涎娱L晚期膀胱癌患者的生存期,但是其總體預(yù)后依然很差[3],其中一個重要的原因是對順鉑耐藥。因此,增強膀胱癌細胞對順鉑的敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥是一種值得期待的治療策略,對晚期膀胱癌治療有重大的臨床意義。順鉑的主要抗腫瘤機制是造成腫瘤細胞DNA損傷,它能引發(fā)腫瘤細胞的DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response, DDR) [4]。適量的DNA損傷可以被識別并通過多種修復(fù)途徑得以修復(fù),相反,若DNA損傷無法得到有效的修復(fù),細胞將會導(dǎo)致凋亡[5-8]。DDR包括細胞周期檢測點通路激活、DNA修復(fù)、凋亡等過程協(xié)調(diào)進行。細胞周期檢測點的激活對維持基因組穩(wěn)定、細胞生存尤為重要,因為它的激活可以阻滯細胞周期進程,為DNA的修復(fù)提供時間[9]。ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related Protein, ATR)是DNA損傷反應(yīng)中的一個關(guān)鍵激酶和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。主要有兩種功能,第一,DNA損傷可激活A(yù)TR蛋白,使ATR與DNA損傷位點結(jié)合,進一步磷酸化并激活檢測點激酶1(checkpoint kinase 1, Chkl),激活檢測點通路最終導(dǎo)致周期阻滯為DNA修復(fù)爭取時間[10]；第二,ATR能夠磷酸化DNA修復(fù)相關(guān)蛋白,直接調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)過程[11]。DNA損傷后,ATR結(jié)合于DNA的損傷位點并磷酸化Chkl,pChk1又繼續(xù)磷酸化Cdc25蛋白,Cdc25是一種磷酸酶,磷酸化的Cdc25 (pCdc25)是一種失活的狀態(tài),因而不能去除細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin dependent kinase. CDK)的抑制性磷酸化,導(dǎo)致細胞周期不能向下進展,從而有時間修復(fù)DNA損傷、并且避免了受損的DNA遺傳信息傳至子代細胞[5,11]。順鉑等DNA損傷藥物可以激活A(yù)TR通路,激發(fā)細胞的DNA修復(fù),DNA修復(fù)的異常調(diào)節(jié)與化療抵抗密切相關(guān)[12,13]。因此,抑制ATR-Chk1通路可能成為一種增強DNA損傷化療藥物效能的重要策略[10]。正常細胞有完整的G1期和S/G2M的檢測點通路保證基因組穩(wěn)定,而腫瘤細胞常常缺少G1期檢測點通路[14-20]。ATM和ATR是DNA損傷反應(yīng)中兩個主要的信號傳導(dǎo)者,ATR主要負責(zé)S/G2M期的檢測點通路激活,而ATM可激活G1檢測點通路[10,21]。腫瘤細胞通常由于ATM/p53通路缺陷,主要依靠ATR相關(guān)的S/G2M的檢測點通路激活導(dǎo)致周期阻滯而進行DNA修復(fù)[22-27]。因此,正常細胞由于有完整的G1、S/G2M的檢測點通路,抑制ATR-Chk1檢測點通路后,可以通過G1期檢測點通路完成DNA修復(fù),而腫瘤細胞G1期檢測點通路功能缺陷,更加依賴S/G2M期ATR通路的激活以修復(fù)DNA損傷,ATR-Chk1通路抑制后能夠特異性的增強腫瘤細胞對DNA損傷藥物的效果[28-30]。Cdc6 (Cell division cycle 6)是重要的復(fù)制起始蛋白,在G1期,Cdc6可以組裝前復(fù)制復(fù)合體(pre-replicative complexes, pre-RC)于復(fù)制起始位點,啟動DNA復(fù)制[31]。一旦復(fù)制啟動,Cdc6就被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。但是研究發(fā)現(xiàn),DNA復(fù)制啟動后依然有相當一部分Cdc6停留于細胞核,這說明Cdc6除了組裝pre-RC蛋白以啟動DNA復(fù)制外還有其他重要功能[32]。最近研究發(fā)現(xiàn),Cdc6與ATR通路的激活有關(guān),Cdc6能與ATR發(fā)生物理性的相互作用,在DNA損傷環(huán)境下,Cdc6對ATR相關(guān)的檢測點通路激活有重要作用[33]。在酵母菌中,Cdc6定位于染色Rad3-Rad26復(fù)合體(與哺乳動物細胞ATR-ATRIP同源)的受體簽,清除Cdc6蛋白會抑制Rad3(與ATR同源)和Rad26(與ATRIP)與梁色質(zhì)的結(jié)合[34]。此外,Cdc6與多種腫瘤發(fā)展預(yù)后密切相關(guān)[35-40]。Cdc6在膀胱癌組織中的表達如何,Cdc6對于膀胱癌的腫瘤特性有何影響、Cdc6與ATR檢測點通路與順鉑抵抗間的關(guān)系尚未見報道。去甲斑蟊素(Norcantharidin, NCTD)是斑蟊素去掉甲基的產(chǎn)物,斑蟊素是從中藥斑蝥中提取的抗腫瘤成分,當它去掉甲基后保留了原有的抗腫瘤活性,而且減少了對泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的副作用[41,42]。研究發(fā)現(xiàn)NCTD可以使多種腫瘤中Cdc6表達下降[43-45]。那么NCTD對膀胱癌細胞尤其是耐藥的膀胱癌細胞中Cdc6的表達是否有同樣的抑制作用呢?NCTD是否能夠通過抑制Cdc6,從而抑制ATR-Chkl通路,導(dǎo)致DNA修復(fù)能力減弱而增強順鉑抗腫瘤作用、逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥呢?研究目的、方法和結(jié)果第一部分：Cdc6在膀胱癌組織、膀胱癌細胞系表達特征實驗?zāi)康暮头椒ǎ簽樘剿鰿dc6在膀胱癌中的表達及與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系我們進行了這部分試驗：1.Western blot檢測膀胱癌臨床標本中癌組織和癌旁組織Cdc6的表達；2.組織芯片免疫組化染色,探索Cdc6與膀胱癌臨床病理結(jié)果的關(guān)系；3.檢測膀胱癌細胞系中Cdc6的表達。實驗結(jié)果：第一,Western blot結(jié)果提示所有12例膀胱尿路上皮癌病人癌組織的Cdc6表達都顯著的高于相應(yīng)的癌旁邊組織(P0.05)；第二,組織芯片免疫組化結(jié)果提示,115例癌組織中有81例患者Cdc6為陽性高表達(70.43%),在50例癌旁邊組織中僅有3例Cdc6為陽性高表達(6%),癌組織的高表達性率顯著高于癌旁組織(P=0.000)；在44例高級別尿路上皮癌組織中,有37例為Cdc6陽性高表達(陽性率:84.09%),在71例低級別尿路上皮癌組織中,有44例為陽性表達(陽性率：61.97%),兩者有統(tǒng)計堂羞顯；第三,在82例肌層浸潤性性尿路上皮癌中,有62例為Cdc6陽性(陽性率：75.61%),而33例非肌層侵潤性膀胱尿路上皮癌中,有19例為Cdc6陽性(陽性率：57.56%),但是兩者比較無顯著性差異；第四,Cdc6的陽性率在不同年齡組及性別間無顯著性差異。此外我們還檢測了T24、UMUC3、5637膀胱癌細胞系的Cdc6表達,發(fā)現(xiàn)Cdc6普遍表達于膀胱癌細胞,其中UMUC3細胞系Cdc6表達最高,T24次之,5637細胞最少。第二部分：Cdc6沉默對膀胱癌的腫瘤特性影響目的和方法：研究表明Cdc6對DNA復(fù)制的起始至關(guān)重要,我們的研究表明Cdc6在膀胱癌組織中高表達且與病理分級相關(guān)。這探索Cdc6對膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲的影響,我們選取UMUC3及T24細胞作為研究對象,以siRNA作為干預(yù)手段,通過Brdu摻入實驗、劃痕實驗、Transwell遷移、侵襲實驗,探索下調(diào)Cdc6的表達對膀胱癌細胞DNA復(fù)制、遷移、侵襲的影響。研究結(jié)果：Si-Cdc6降低Cdc6表達,UMUC3、T24細胞的Brdu陽性率(DNA復(fù)制標志)明顯減少,劃痕實驗及Transwell遷移、侵襲實驗都表明抑制Cdc6的表達能夠明顯地延長劃痕愈合時間,顯著減少穿過Transwell室的細胞數(shù)目。第三部分：篩選耐藥膀胱癌細胞并比較非耐藥細胞與耐藥細胞Cdc6及ATR表達實驗?zāi)康暮头椒ǎ簽檠芯堪螂装┠退帣C制,我們首先要獲得耐藥的膀胱癌細胞。我們利用順鉑長期間斷作用的方式來篩選耐藥的膀胱癌細胞,并通過MTS細胞增殖活力實驗證實,篩選出的UMUC3R細胞對順鉑的耐受力是否更強。順鉑作主要的作用機制在于導(dǎo)致腫瘤細胞DNA的損傷,從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。那么我們推測,膀胱癌細胞對順鉑的耐藥可能是由于耐藥細胞對順鉑造成的DNA損傷有更為強大的修復(fù)功能。鑒于ATR在DNA損傷反應(yīng)中的關(guān)鍵作用以及Cdc6與ATR的密切關(guān)系,我們推測,耐藥的膀胱癌細胞中高表達的Cdc6能夠促進ATR與DNA損傷位點結(jié)合,更有效地激活檢測點通路,使其細胞DNA修復(fù)增強。通過Chromatin binding實驗分離與染色質(zhì)結(jié)合和非結(jié)合的蛋白,檢測UMUC3和UMUC3R細胞中ATR和Cdc6在染色質(zhì)結(jié)合與非結(jié)合部分的表達。實驗結(jié)果：第一,MTS細胞增殖活力實驗證實,在相同的順鉑濃度和作用時間下,通過順鉑篩選后的UMUC3R細胞的細胞活動明顯強于UMUC3細胞,隨著順鉑作用的時間和濃度增加對順鉑的耐藥性表現(xiàn)更為突出。第二,ATR的Chromatin binding實驗結(jié)果提示,在順鉑濃度為0μg/mL時,相對耐藥的UMUC3R魚chromatin binding ATR的表達量更高,這意味著耐藥的UMUC3R細胞中的ATR處于一個相對激活的狀態(tài)。第三,在順鉑導(dǎo)致DNA損傷后,兩種細胞的ATR表達都升高,但是耐藥的UMUC3R細胞在受順鉑刺激后,chromatin binding ATR對于UMUC3細胞表達量更多,這提示UMUC3R細胞有更多的ATR進入細胞核,以啟動ATR的檢測點通路來修復(fù)受損的DNA。第四,Cdc6的Chromatin binding實驗結(jié)果提示,當順鉑作用膀胱癌腫瘤細胞后,DNA的復(fù)制受到抑制,所以Cdc6的表達下降,在相同嘗試順鉑作用后,相對耐藥的UMUC3R細胞中Chromatin binding Cdc6的表達量高于未經(jīng)順鉑篩選的UMUC3細胞；第五,UMUC3R細胞在不同濃度的順鉑作用后,隨著順鉑濃度的加大,chromatin binding Cdc6并沒有明顯減少,這說明順鉑耐藥的UMUC3R,在DNA受損后,與染色質(zhì)結(jié)合的Chromatin binding Cdc6更加穩(wěn)定,相對于UMUC3細胞,chromatin binding Cdc6表達增高。鑒于Cdc6與ATR的密切關(guān)系,UMUC3R細胞順鉑耐藥的機制可能是其DNA損傷時Chromatin binding Cdc6加穩(wěn)定,促進ATR邀活入核結(jié)合于DNA損傷部位,更有效地啟動檢測點通DNA修復(fù)。第四部分：探索抑制Cdc6表達是否增強順鉑對相對耐藥的UMUC3R和非耐藥的UMUC3細胞的凋亡誘導(dǎo)作用實驗?zāi)康暮头椒ǎ旱谝?為檢測抑制Cdc6(Si-Cdc6)是否能夠增強順鉑(CDDP)對膀胱癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用、逆轉(zhuǎn)膀胱癌耐藥,我們選取耐藥的UMUC3R和非耐藥的UMUC3細胞,分為Si-Cdc6+CDDP組、CDDP組、Si-Cdc6組、Si-negative control組,用Annixin V-PI雙染法行凋亡染色并流式檢測凋亡率。研究結(jié)果：第一,在4ug/ml的順鉑作用后,UMUC3R細胞的凋亡率平均為9.2%,明顯低于UMUC3細胞(21%),P0.05,再次證明UMUC3R細胞對順鉑的耐藥性;第二,UMUC3R細胞Si-Cdc6+CDDP聯(lián)合作用組凋亡率(21.5%)明顯高于CDDP單獨作用組(9.2%),UMUC3細胞的Si-Cdc6+CDDP聯(lián)合作用組凋亡率(37.7%)明顯高于CDDP單獨作用組(21%),P值均0.05第三,Si-Cdc6干擾能夠誘導(dǎo)UMUC3R和UMUC3細胞少量的凋亡,凋亡率分別是(4.9%,5.0%)。兩種細胞聯(lián)合腹脹組的凋亡率都明顯大于Si-Cdc6或者順鉑單獨作用。這說明,Cdc6干擾后能增強膀胱癌細胞對順鉑的敏感性。第五部分:探索抑制Cdc6逆轉(zhuǎn)膀胱癌順鉑耐藥的機制實驗?zāi)康暮头椒ǎ篈TR是細胞受到DNA損傷啟動DNA修復(fù)的重要蛋白,研究認為,Cdc6能夠與ATR相作用,促進ATR與DNA受損部位結(jié)合,因此我們推測,Cdc6干擾逆轉(zhuǎn)UMUC3R細胞耐藥的機制可能是抑制Cdc6導(dǎo)致后續(xù)的ATR-Chkl-Cdc25檢測點通路失活,不能引起DNA修復(fù)必需的周期阻滯,最終細胞在存在DNA損傷情況下進入下一細胞周期造成異常有絲分裂。為檢測干擾Cdc6表達對UMUC3R細胞的ATR-Chkl-Cdc25C通路影響,我們通過Chromatin binding和Western blot檢測了Cdc6干擾后,與染色質(zhì)結(jié)合的ATR、磷酸化Chk1和Cdc25的表達;通過PI染色流式周期測試,檢測細胞是否突破檢測點通路的周期阻滯；通過pH3(有絲分裂標志)和γ-H2AX(DNA損傷標志)的免疫熒光染色,觀測干擾Cdc6后是否出現(xiàn)未完成DNA修復(fù)而異常進入有絲分裂腫瘤細胞。研究結(jié)果：第一,順鉑能夠激活A(yù)TR-Chk1-Cdc25C通路,下調(diào)Cdc6蛋白的表達后,Chromatin binding ATR達下降,下游Chk1、Cdc25C的磷酸化也相應(yīng)下降,這意味Si-Cdc6抑制了整條ATR通路的激活；第二,細胞周期分析顯示,SiRNA下調(diào)Cdc6表達后,導(dǎo)致G1期細胞增多,S期數(shù)目減少,Cdc6干擾后,Cdc6的表達下降,削弱了Cdc6組裝為前復(fù)制復(fù)合體的功能,導(dǎo)致DNA復(fù)制啟動受到抑制,從而細胞阻滯在G1期；第三,順鉑導(dǎo)致DNA損傷,形成S期阻滯,Cdc6沉默能夠突破順鉑導(dǎo)致的S期阻滯,使細胞異常地進入到G2/M期,G2M期細胞增多。pH3(有絲分裂標志)及γ-H2AX(DNA損傷標志)免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),順鉑導(dǎo)致有絲分裂期細胞(pH3+)減少,并導(dǎo)致了一定比例的DNA損傷(γ-H2AX+,29%),當Si-Cdc和CDDP聯(lián)合作用時,UMUC3R細胞的DNA損傷加重(-H2AX+細胞增多,48.8%),而且出現(xiàn)了DNA損傷未完成修復(fù)而異常進入有絲分裂期的細胞(pH3+-γ-H2AX+雙陽性細胞,7.6%)。說明干擾Cdc6表達后,細胞沒有有效的完成DNA修復(fù),并且突破ATR檢測點激活導(dǎo)致的周期阻滯,導(dǎo)致細胞帶著DNA損傷異常進入有絲分裂期。第六部分：通過順鉑抵抗膀胱癌裸鼠移植瘤模型,探索在體內(nèi)通過去甲斑螯素(NCTD)抑制Cdc6是否能夠逆轉(zhuǎn)耐藥目的和方法：第一,首先我們探索了NCTD是否能夠抑制膀胱癌細胞的Cdc6表達,利用Western blot檢測NCTD作用后Cdc6表達,證實NCTD對膀胱Cdc6的抑制作用；第二,為檢測在體內(nèi)抑制Cdc6表達是否能通過抑制ATR通路,從而增強順鉑(CDDP)抗腫瘤作用,我們用相對耐藥的UMUC3R膀胱癌細胞構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后分為NCTD+CDDP聯(lián)合組,NCTD組、CDDP組、空白對照(Ctr1)組4組,按組行藥物腹腔注射,觀察腫瘤生長速度,并對腫瘤組織進行免疫組化分析,檢測Cdc6、ATR、γ-H2AX表達,以反映Cdc6的抑制情況、ATR通路的激活情況及DNA損傷情況。研究結(jié)果：第一,Western blot結(jié)果證實去甲斑蟊素(NCTD)能夠抑制UMUC3R和UMUC3細胞中Cdc6的表達；第二,動物實驗結(jié)果顯示,順鉑或去甲斑蟊素單獨作用組,耐藥膀胱癌移植瘤生長速度相對于空白對照組減慢,但腫瘤依然逐漸增大,這說明順鉑或去甲斑蝥素對耐藥的UMUC3R移植瘤生長有一定的延緩作用,但是不能縮小腫瘤,單獨運用順鉑并不能起到有效的殺傷腫瘤作用；第三,順鉑+去甲斑蟊素聯(lián)合運用對腫瘤生長抑制作用最強,而且在第15天時腫瘤的體積有明顯的減小趨勢,這說明耐藥的UMUC3R移植瘤受到了有效的殺傷；第四,小鼠腫瘤免疫組化結(jié)果提示,去甲斑蝥組的Cdc6表達明顯低于空白對照組,這說明接受去甲斑蟊素治療的腫瘤內(nèi)Cdc6的表達受到了抑制。在去甲斑蝥素+順鉑聯(lián)合組,Cdc6的表達最弱,ATR的表達明顯弱于順鉑組,γ-H2AX的表達比順鉑單獨作用明顯增多,這說明聯(lián)合組的ATR檢測點通路受到抑制,從而無法造成周期阻滯為DNA修復(fù)提供時間,也難以啟動DNA修復(fù),最終造成大量的DNA損傷(γ-H2AX高表達)。去甲斑蝥素能夠抑制Cdc6表達,導(dǎo)致ATR檢測點通路激活受抑制,從而提高順鉑對腫瘤細胞的DNA損傷能力,抑制腫瘤生長,逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。研究結(jié)論綜上所述,Cdc6在膀胱癌組織中高表達,并且與膀胱癌的病理分級相關(guān)。抑制Cdc6可以抑制膀胱癌腫瘤細胞的DNA復(fù)制、遷移和侵襲,通過順鉑長期間斷作用篩選出相對耐藥的UMUC3R細胞,發(fā)現(xiàn)在順鉑作用下,UMUC3R中染色質(zhì)結(jié)合的Chromatin binding Cdc6表達相對于非耐藥的UMUC3細胞更高且更加穩(wěn)定,且能激活更多的ATR與染色質(zhì)結(jié)合。抑制Cdc6表達可以抑制ATR-Chkl檢測點通路活性,使細胞突破檢測點通路的周期阻滯,腫瘤細胞在DNA未完全修復(fù)情況下進入到有絲分裂期,從而增強順鉑的凋亡誘導(dǎo)作用,逆轉(zhuǎn)UMUC3R細胞對順鉑的抵抗。動物實驗通過去甲斑蟊素抑制Cdc6表達,也可以增強順鉑對腫瘤的殺傷,逆轉(zhuǎn)對順鉑耐藥,免疫組化也證實NCTD+CDDP聯(lián)合,抑制了Cdc6表達,從而ATR通路的激活受到抑制,最終增強了DNA損傷(y-H2AX表達升高)。正常細胞有完整的G1期和S/G2M的檢測點通路保證基因組穩(wěn)定,而腫瘤細胞常常缺少的G1期檢測點通路[14-20]。ATR主要負責(zé)S/G2M期的檢測點通路激活,而ATM可激活G1檢測點通路[10,21]。腫瘤細胞更加依賴S/G2M期發(fā)揮作用的ATR相關(guān)的的檢測蹼通路,以形成周期阻滯并調(diào)節(jié)進行DNA修復(fù)[22-27]。因此,正常細胞由于有完整的G1、S/G2M的檢測點通路,抑制ATR-Chk1檢測點通路后,可以通過G1期檢測點通路完成DNA修復(fù),而腫瘤細胞G1期檢測點通路功能缺陷,ATR-Chk1通路抑制后能夠特異性的增強DNA損傷藥物對腫瘤細胞的效果[28-30]。Cdc6在膀胱癌組織中高表達,在分化化良好的正常組織中表達較少。抑制Cdc6可以相對特異性的抑制腫瘤DNA復(fù)制、遷移、侵襲,Cdc6表達下調(diào)還可以抑制ATR-Chk1激活,特異性地增強順鉑對膀胱癌細胞的DNA損傷,而正常細胞DNA損傷,而正常細胞具有完整G1、S、G2M期檢測點通路激活,對ATR檢測點通路依賴性不強,從而不增加正常細胞的DNA損傷。因此,Cdc6可能成為相對特異的抗擊膀胱癌、逆轉(zhuǎn)膀胱癌順鉑抵抗的靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14

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本文編號：1620616