本文選題：常染色體顯性多囊腎病　切入點(diǎn)：巨噬細(xì)胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一種因多囊蛋白1或2(polycystic protein,PC1/PC2)編碼基因(PKD1/PKD2)突變導(dǎo)致的,以雙側(cè)、多發(fā)并逐漸增長(zhǎng)的液性囊腫壓迫及破壞周圍正常腎組織,引起腎臟不可逆性功能喪失,最終導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的單基因遺傳性疾病。ADPKD居ESRD病因的第四位。其中PKD1突變型占ADPKD的75%。炎癥及免疫因素在ADPKD發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用。作為發(fā)揮重要功能的免疫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞與ADPKD進(jìn)展關(guān)系更為密切。早期研究發(fā)現(xiàn)無論是ADPKD患者還是多囊腎病模型動(dòng)物腎臟標(biāo)本中均可見大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),且表現(xiàn)為M2型。而清除模型動(dòng)物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞可以顯著延緩多囊腎病的進(jìn)展。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則證實(shí)巨噬細(xì)胞可以通過分泌可溶性細(xì)胞因子促進(jìn)囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖,但具體是何因子尚不知曉。研究方法:通過條件性敲除小鼠體內(nèi)Pkd1基因使其表現(xiàn)出與人類多囊腎病近似表型。研究小鼠多囊腎病發(fā)病過程中囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖速率、囊腫指數(shù)及腎功能變化的規(guī)律。通過免疫組化染色(IHC),在多時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行Pkd1敲除小鼠腎組織內(nèi)巨噬細(xì)胞染色及計(jì)數(shù),明確巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與腎囊腫增殖速度的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)并證實(shí)早期發(fā)病的Pkd1敲除小鼠腎臟增殖呈雙峰變化,第二個(gè)高峰起點(diǎn)出生后第24天(P24),峰值點(diǎn)在P32。利用基因芯片比較兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠腎組織中mRNA表達(dá)譜,在差異性表達(dá)基因中尋找與巨噬細(xì)胞活化、極化、遷徙等有關(guān)的因子,篩選出關(guān)鍵因子精氨酸酶1(ARG1)。利用QPCR技術(shù)檢測(cè)及比較P24和P32兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的共計(jì)14個(gè)巨噬細(xì)胞極化關(guān)鍵因子在腎組織mRNA的變化差異,證實(shí)ARG1是差異最為顯著的因子。隨后通過激光共聚焦免疫熒光多重染色,比較浸潤(rùn)在腎組織中的巨噬細(xì)胞內(nèi)極化標(biāo)記分子(NOS2、ARG1、TNFα、CD206、TGFβ和IL10)在ADPKD不同發(fā)病階段的表達(dá)差異,再次證實(shí)ARG1在巨噬細(xì)胞中呈逐步表達(dá),在P22-24天時(shí)開始增高,而在P32天時(shí)呈極高表達(dá),與囊腫增殖速度趨勢(shì)完全重合。微觀方面,在多時(shí)間點(diǎn)利用免疫熒光三重染色證實(shí)巨噬細(xì)胞表達(dá)ARG1強(qiáng)度與周圍組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例的關(guān)系。宏觀方面,利用免疫熒光全片掃描技術(shù)計(jì)算在一個(gè)完整橫截面下F4/80陽(yáng)性及ARG1陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù),分析不同標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞總數(shù)與同一截面下囊腫指數(shù)、大囊腫(直徑"g1000μm)及中等大小囊腫(直徑500~1000μm)數(shù)量的相關(guān)性。通過上述結(jié)果,我們將早期發(fā)病的Pkd1敲除小鼠發(fā)病階段劃分為兩段,即發(fā)育相關(guān)增殖階段(P12-P24)和巨噬細(xì)胞促增殖階段(P24-P32)。以兩個(gè)階段為基礎(chǔ),利用氯磷酸二鈉脂質(zhì)體分三個(gè)干預(yù)時(shí)段清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞,比較不同干預(yù)期小鼠腎功能、囊腫指數(shù)、腎臟增殖率等一系列指標(biāo)。利用ARG1特異性抑制劑Nor-NOHA干預(yù)小鼠體內(nèi)精氨酸代謝通路,并觀察是否可以延緩ADPKD的進(jìn)展。最后,利用代謝組學(xué)、基因芯片及IHC等方法證明巨噬細(xì)胞通過調(diào)控自身ARG1的表達(dá),影響精氨酸-鳥氨酸-多胺代謝通路并由此刺激囊腫快速增長(zhǎng),而Nor-NOHA通過干擾這一通路有效延緩了ADPKD的進(jìn)展。結(jié)果:(1)早期發(fā)病的Pkd1敲除鼠腎臟經(jīng)歷兩個(gè)增殖高峰,第一個(gè)高峰在P18,與腎臟發(fā)育有關(guān),變化趨勢(shì)與野生型近似;第二個(gè)高峰在P32,與野生型顯著不同(野生型腎增殖率在第一峰下降后不再提高);(2)早期發(fā)病的Pkd1敲除鼠腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)規(guī)律:P18開始出現(xiàn),P24-P26顯著增多,直至P32處死時(shí)腎間質(zhì)中始終大量浸潤(rùn);(3)ARG1是與ADPKD增殖速度最為密切的巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記分子;(4)無論在空間上還是時(shí)間上,表達(dá)ARG1的巨噬細(xì)胞與囊腫增長(zhǎng)速度均呈顯著正相關(guān);(5)第一階段(P12-22)清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞并不能改變多囊腎表型、囊腫增長(zhǎng)速度和腎功能損害程度;而第二階段(P22-32)清除巨噬細(xì)胞后可以顯著改善早發(fā)型多囊腎小鼠的上述指標(biāo),且與全程(P12-P32)清除巨噬細(xì)胞的治療效果無顯著差異;(6)ARG1抑制劑Nor-NOHA對(duì)早發(fā)型Pkd1敲除鼠ADPKD進(jìn)展的治療效果不理想;(7)晚發(fā)型Pkd1敲除鼠在ADPKD發(fā)病規(guī)律上與早發(fā)型小鼠十分近似,在Pkd1敲除后(P28)的第5個(gè)月開始出現(xiàn)腎臟微囊,在10月齡時(shí)呈現(xiàn)與早發(fā)型多囊腎小鼠完全一致的ADPKD表型,且兩者基因表達(dá)譜也十分近似;(8)Nor-NOHA通過影響ARG1的活性抑制精氨酸向鳥氨酸轉(zhuǎn)化,并由此顯著的抑制了晚發(fā)型Pkd1敲除鼠ADPKD的疾病進(jìn)展;(9)巨噬細(xì)胞通過上調(diào)自身ARG1的表達(dá),抑制NO合成,促進(jìn)鳥氨酸生成,并由于ADPKD發(fā)病過程中鳥氨酸—多胺代謝通路多個(gè)酶的活化,促使多胺產(chǎn)生增加,最終刺激囊腫上皮細(xì)胞增殖及囊腫增長(zhǎng)。結(jié)論:(1)ARG1陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞真正刺激囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖及囊腫增長(zhǎng);(2)巨噬細(xì)胞通過調(diào)控自身ARG1的表達(dá),改變巨噬細(xì)胞內(nèi)鳥氨酸和一氧化氮的合成量,生成大量多胺代謝底物,參與鳥氨酸-多胺代謝通路并由此刺激囊腫快速增長(zhǎng);(3)Nor-NOHA可以在一定程度上糾正多囊腎微環(huán)境中巨噬細(xì)胞內(nèi)ARG1/NOS2失衡,影響鳥氨酸形成,通過減少多胺代謝通路的底物進(jìn)而干擾整個(gè)代謝途徑,有望成為另一個(gè)ADPKD有效的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：1615037