本文選題：常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)　切入點：mTOR　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著醫(yī)療檢測水平和人們健康知識水平的不斷提高,常染色體顯性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD),已經(jīng)逐漸被人們所熟知。這種最常見的單基因遺傳性腎病,其發(fā)病率之高,并發(fā)癥之重,給患者家庭和整個社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。ADPKD的發(fā)病率約為1/400-1/1000,其病理特點是雙腎滿布大小不等、充滿囊液的液性囊泡,隨著病程的進(jìn)展、囊液的不斷分泌和蓄積,囊泡不斷增大,同時壓迫臨近的正常腎組織,最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的不可逆損傷。據(jù)統(tǒng)計,ADPKD患者在60歲以后,約有一半以上的患者會進(jìn)展到終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)。ADPKD目前尚無有效的治療方法,病人進(jìn)入ESRD后,主要的治療措施為透析治療包括血液透析,腹膜透析和腎臟移植治療。目前認(rèn)為ADPKD的致病基因主要包括兩個即多囊腎病基因1(Polycystic kidney disease 1 gene,PKD1)和多囊腎病基因2(Polycystic kidney disease 2 gene,PKD2)。PKD1和PKD2編碼的蛋白分別為多囊蛋白l(polycystin-l,PCl)和多囊蛋白2(polycystin-2,PC2),PCl和PC2在胞內(nèi)側(cè)通過C末端相互作用構(gòu)成復(fù)合體,起到陽離子通道作用,通過感受機(jī)械壓力等各種刺激,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣離子的內(nèi)流,傳遞細(xì)胞信號。但是近幾年在臨床發(fā)現(xiàn)部分有ADPKD臨床表現(xiàn)的患者,卻沒有發(fā)現(xiàn)以上兩個基因位點的突變,提示我們可能存在pdk1和pkd2之外的致病基因。ADPKD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,近年來研究發(fā)現(xiàn)的致病機(jī)制包括有哺乳動物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度上調(diào),血管加壓素V2受體介導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)異常激活效應(yīng),纖毛機(jī)械-鈣離子內(nèi)流障礙,補(bǔ)體旁路的過度激活以及酪氨酸激酶(Janus Kinase,JAK)—轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號通路的異常活化等。目前對于ADPKD的治療藥物研究主要是針對以上的研究機(jī)制,但是仍然沒有一個治療效果確切并且副作用又小的特效藥物,因此繼續(xù)探索和研發(fā)治療ADPKD的有效藥物仍是一個急需解決的醫(yī)學(xué)問題。因此本研究采用了新型mTOR抑制劑Y31來研究其對Han:SPRD多囊腎病大鼠的治療作用及可能作用機(jī)制。Y31由長征醫(yī)院腎內(nèi)科與中國科學(xué)院藥物研究所共同研發(fā)。前期研究發(fā)現(xiàn)其藥代動力學(xué)與水溶性等特性要明顯優(yōu)于Rapamycin,有可能成為新的治療ADPKD的有效藥物。mTOR抑制劑對于mTOR的抑制作用已經(jīng)明確,而mTOR對于JAK-STAT1/3的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)有越來越多的研究,而本科室前期的研究表明,JAK-STAT1/3對于補(bǔ)體B因子(CFB)有正向調(diào)控作用,而CFB通過活化巨噬細(xì)胞等作用促進(jìn)多囊腎病的發(fā)生發(fā)展也已經(jīng)被證實,因此我們考慮mtor抑制劑可能會通過jak-stat1/3這一途徑影響補(bǔ)體b因子的表達(dá),進(jìn)而干預(yù)多囊腎病的疾病進(jìn)程,所以在本研究還會觀察mtor抑制劑對于補(bǔ)體系統(tǒng)的影響。傳統(tǒng)mtor抑制劑在臨床試驗中未能取得令人滿意的效果,考慮其原因一方面為,相比動物實驗用藥,患者口服藥物劑量較小,另一方面的原因可能為mtor被抑制后,其負(fù)反饋通路pi3k-akt通路被激活,最終導(dǎo)致mtor抑制不完全,治療效果不理想,此外傳統(tǒng)rapamycin水溶性差導(dǎo)致腎臟局部藥物濃度偏低也可能是重要原因之一。因此本研究擬通過聯(lián)合用藥,多靶點治療,實現(xiàn)對多囊腎病大鼠的有效治療。二甲雙胍(metformin),是目前治療2型糖尿病的一線降糖藥物,它是目前公認(rèn)的amp依賴的蛋白激酶(ampk)激動劑,ampk活化后,可以通過直接或間接方式抑制mtor,此外它還可以通過激活具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸梅活性的雙重特異性磷酸酶pten來抑制pi3k-akt通路的激活,進(jìn)而抑制mtor的活化。因此本研究擬通過新型mtor抑制劑y31與metformin的聯(lián)合用藥來實現(xiàn)多靶點治療。由于metformin自身有mtor抑制作用,因此聯(lián)合用藥可以減少mtor抑制劑的使用劑量,進(jìn)而可以減少mtor抑制劑所帶來的感染等并發(fā)癥,同時metformin具有激活pten進(jìn)而抑制pi3k-akt通路的作用,可以降低甚至阻斷抑制mtor后所導(dǎo)致的負(fù)反饋通路激活。這樣聯(lián)合用藥治療多囊腎病的模式在adpkd研究中尚屬首次,旨在通過本研究,為臨床治療adpkd探索新的治療物藥及治療模式。研究方法采用多囊腎病動物模型han:sprd多囊腎病大鼠和人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞wt9-12細(xì)胞系,通過灌胃等給藥方式給藥,內(nèi)眥及心臟取血等方法取血檢測腎功能指標(biāo),來評價藥物的治療作用;使用westernbloting,組織病理切片染色,mtt等實驗方法,檢測藥物對大鼠腎臟組織以及wt9-12細(xì)胞中mtor通路相關(guān)蛋白p-p70s6k及mtor負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白分子p-akt表達(dá)量的變化,檢測補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)蛋白補(bǔ)體b因子(cfb)及補(bǔ)體c3降解片段表達(dá)量的變化,觀察藥物對大鼠腎臟囊腫生長及細(xì)胞增殖的影響等以探討藥物的作用機(jī)制。研究結(jié)果在第一部分動物實驗中,與多囊腎病對照組(ctrl)相比,陽性對照藥物rapa(1mg/kg)以及治療藥物y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以顯著降低han:sprd多囊腎病大鼠的雙腎重體重比、囊腫指數(shù)指標(biāo)以及血肌酐和尿素氮,實驗終點發(fā)現(xiàn)給予y312mg/kg組體重下降比較明顯,與ctrl組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。在第二部分動物實驗中,與多囊腎病對照組(ctrl)相比,陽性對照藥物rapa(0.5mg/kg和1mg/kg)以及治療藥物metformin(150mg/kg)和y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以降低han:sprd多囊腎病大鼠的雙腎重體重比以及血肌酐和尿素氮,實驗終點發(fā)現(xiàn)給予y312mg/kg組體重下降比較明顯,與ctrl組相比有統(tǒng)計學(xué)差異;與多囊腎病對照組(ctrl)相比,聯(lián)合用藥組均可以降低han:sprd多囊腎病大鼠的雙腎重體重比以及血肌酐和尿素氮,實驗終點發(fā)現(xiàn)met150mg/kg聯(lián)合y312mg/kg組體重下降比較明顯,與ctrl組相比有統(tǒng)計學(xué)差異;但是聯(lián)合用藥未出現(xiàn)藥物的協(xié)同或者疊加效應(yīng),在腎功能血肌酐及尿素氮的保護(hù)方面,聯(lián)合用藥組明顯優(yōu)于相應(yīng)的met單藥,且肌酐和尿素氮的下降有統(tǒng)計學(xué)差異,但是與相應(yīng)的mtor抑制劑組相比肌酐和尿素氮的下降沒有統(tǒng)計學(xué)差異。在第三部分動物實驗中,與多囊腎病對照組(ctrl)相比,metformin(250mg/kg)單藥治療,metformin與rapa聯(lián)合用藥治療以及rapa(0.5mg/kg)單藥治療均可顯著降低han:sprd多囊腎病大鼠的血肌酐和尿素氮,聯(lián)合用藥組的治療效果要明顯優(yōu)于metformin單藥,但是與rapa單藥治療組相比,相應(yīng)腎功能的改善并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。westernblotting結(jié)果顯示,y31(0.5mg/kg和2mg/kg)同rapa(1mg/kg)一樣,可以顯著降低han:sprd多囊腎病大鼠腎臟組織中mtor通路下游蛋白p-p70s6k的表達(dá)量;而y31(0.5mg/kg)及rapa(1mg/kg)可以一定程度的增加han:sprd多囊腎病大鼠腎臟組織中mtor負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中相關(guān)蛋白p-akt的表達(dá)量,但是y31(2mg/kg)卻能顯著降低p-akt的表達(dá)量。westernblotting方法結(jié)果顯示,y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及rapa(1mg/kg)可以顯著降低han:sprd多囊腎病大鼠腎臟組織中補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)蛋白補(bǔ)體b因子(cfb)以及補(bǔ)體c3降解片段c3b和c3c的表達(dá)量。免疫組化檢測顯示y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及rapa(1mg/kg)可以顯著降低han:sprd多囊腎病大鼠腎臟組織切片中增殖細(xì)胞核抗原ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量。mtt法檢測提示,在人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞wt9-12細(xì)胞中給予不同藥物濃度的y31后,可以抑制wt9-12細(xì)胞的細(xì)胞增殖率,且在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。westernblotting方法結(jié)果顯示,在人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞wt9-12細(xì)胞中給予不同藥物濃度的y31作用后,可顯著減少wt9-12細(xì)胞中mtor通路下游蛋白p-p70s6k蛋白的表達(dá)量,并且高濃度的y31(50um)能顯著降低wt9-12細(xì)胞p-akt的表達(dá)量。westernblotting方法結(jié)果顯示,在人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞wt9-12細(xì)胞中給予不同藥物濃度的y31刺激后,可以顯著減少wt9-12細(xì)胞中補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)蛋白補(bǔ)體B因子(CFB)及補(bǔ)體C3降解片段C3c的表達(dá)量。結(jié)論本研究首先在體內(nèi)動物實驗證實了新型mTOR抑制劑Y31同傳統(tǒng)的mTOR抑制劑具有同樣的抑制mTOR信號通路的作用,并且大劑量的Y31具有抑制mTOR負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白p-AKT表達(dá)的作用。首次提出了mTOR抑制劑對于補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制從而緩解多囊腎病大鼠疾病進(jìn)展的新作用。然而本研究發(fā)現(xiàn),Metformin單藥雖然具有延緩多囊腎病大鼠疾病進(jìn)展的作用,但是與mTOR抑制劑聯(lián)合用藥后未出現(xiàn)聯(lián)合使用藥物的協(xié)同或者疊加作用。在體外細(xì)胞實驗中,亦證明了新型mTOR抑制劑Y31對于mTOR信號通路的抑制作用,高濃度的Y31同樣顯示了對于p-AKT表達(dá)的抑制作用,在細(xì)胞實驗中也再次驗證了其對于補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制作用。因此,通過體內(nèi)和體外實驗研究,證實了新型mTOR抑制劑Y31可以通過抑制mTOR信號通路及補(bǔ)體系統(tǒng)、大劑量的Y31尚可抑制mTOR負(fù)反饋通路中關(guān)鍵蛋白p-AKT的表達(dá)來延緩Han:SPRD大鼠多囊腎病的進(jìn)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692.1

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本文編號：1610601