本文選題：前列腺癌　切入點：融合基因　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:前列腺癌是全世界發(fā)病率最高的男性惡性腫瘤,無論是在美國還是是在中國都是男性高發(fā)的疾病,并在近些年的中國患者中呈明顯上升趨勢。前列腺的研究存在兩個顯著的困境,一是有效地治療靶點,在手術(shù)療法、內(nèi)分泌療法、放化療法和生物療法等治療手段不斷發(fā)展的基礎(chǔ)上,局限性前列腺癌的治愈率在不斷提高,但總死亡率仍是居高不下,根源于治愈患者的復(fù)發(fā)并進(jìn)展為激素抵抗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌。因此,研究前列腺癌浸潤及轉(zhuǎn)移的分子機制,發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌的治療靶點成為目前前列腺癌研究的重點。二是診斷的標(biāo)志物,目前一系列的治療手段均參考于血清PSA的水平。PSA檢測的弊端在于假陽性,導(dǎo)致不必要的穿刺和治療負(fù)擔(dān)。很多年來,研究者們包括臨床工作者致力于尋找更加特異的診斷方式,診斷標(biāo)志物。包括近年興起的有關(guān)前列腺癌的miRNA的研究,Lnc RNA的研究,PSA異構(gòu)體的研究,PSA聯(lián)合長聯(lián)非編碼RNA的共同診斷,血清環(huán)狀RNA的研究,前列腺癌外泌體及外泌體相關(guān)miRNA,蛋白的研究,融合基因的研究。各個領(lǐng)域都力圖尋找到優(yōu)異的前列腺癌診斷標(biāo)志物和治療靶點。融合基因最早成名于血液病中的費城染色體,其開啟了有關(guān)人腫瘤領(lǐng)域的融合基因的研究。該融合基因在血液腫瘤中具有良好的診斷效率,并為該型血液病的治療提供了支持與指導(dǎo)。在此經(jīng)典融合基因之后,各腫瘤領(lǐng)域相繼展開了組織特異性融合基因的探索。有礙于當(dāng)時科研技術(shù)水平的限制,融合基因難以被檢測發(fā)現(xiàn),伴隨著不斷的測序技術(shù)發(fā)展,腫瘤數(shù)據(jù)庫的不斷完善,一些基因的融合被探測出來。前列腺癌領(lǐng)域最早,最經(jīng)典的融合基因是ETS家族相關(guān)的融合基因。該融合基因包含很多種亞型。到此時期,相關(guān)的已發(fā)現(xiàn)的融合基因,都是經(jīng)典的DNA層面的融合。這種融合帶來了優(yōu)秀的診斷效率和預(yù)后指導(dǎo)。伴隨著基因測序技術(shù)的逐步完善,發(fā)現(xiàn)了一些嵌合體RNA,相比較于DNA層面的融合,嵌合體RNA有更好的靈活性,更豐富的剪接方式,極大地擴(kuò)充了有限的人類蛋白編碼基因的范疇,使得人體能夠在基因有限的情況下,擁有更豐富的編碼蛋白或基因調(diào)控方式。而這個時期的嵌合體RNA幾乎指的都是反式剪接,并且反式剪接最早并不是發(fā)現(xiàn)于人類基因組,經(jīng)典的反式剪接首先在錐蟲和線蟲被發(fā)現(xiàn),后期發(fā)現(xiàn)在人類身上。僅此一步,已為融合基因的豐富性打下了良好的基礎(chǔ)。近年,有關(guān)嵌合體的研究中發(fā)現(xiàn)了SLC45A3-ELK4,該嵌合RNA經(jīng)過相關(guān)實驗論證認(rèn)為其不是DNA層面的行為,而是RNA層面的行為,并對其為順式剪接還是反式剪接行為進(jìn)行了論證。研究傾向認(rèn)為,該嵌合體RNA為read through之后的順式剪接,意味著,融合基因的領(lǐng)域又多了一種存在形式,一種更加靈活的形式。目的:鑒定融合基因在前列腺癌組織與前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中是否真實存在,鑒定該融合基因可能擁有的亞型,鑒定該融合基因是否為DNA層面的行為。探索這種融合基因在前列腺癌細(xì)胞中的功能。探索該融合基因的作用機制;篩選前列腺癌與癌旁組織中表達(dá)差異顯著的miRNA,探討MiR-182-5P對前列腺癌增殖、凋亡、侵襲方面的影響。方法:1、在DU145、PC3、LNCa P、22RV1、C42前列腺相關(guān)細(xì)胞系中運用PCR單克隆化的方法檢測TTTY15-USP9Y是否真實存在,鑒別其包含的不同亞型2、在DU145、PC3、LNCa P、RWPE、22RV1、C42前列腺相關(guān)細(xì)胞系中運用RT-PCR方法檢測TTTY15-USP9Y的表達(dá)。3、在結(jié)腸癌細(xì)胞,腎細(xì)胞,及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,肝癌細(xì)胞中以及DU145中進(jìn)行融合基因TTTY15-USP9Y的檢測4、Northern blot對TTTY15-USP9Y的鑒定6、構(gòu)建優(yōu)勢表達(dá)細(xì)胞系DU145的純系單克隆細(xì)胞株7、步移PCR對純系單克隆細(xì)胞株中TTTY15-USP9Y的DNA層面及RNA層面進(jìn)行鑒定。8、利用crispr/cas9技術(shù)對優(yōu)勢表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行DNA層面的雙打靶,并對細(xì)胞進(jìn)行單克隆化,挑選拼接準(zhǔn)確的單克隆細(xì)胞系,人工構(gòu)建具有TTTY15-USP9Y融合基因的細(xì)胞株。9、對人工構(gòu)建后的細(xì)胞株進(jìn)行DNA層面及RNA層面的鑒定,進(jìn)一步幫助確認(rèn)融合基因發(fā)生的層面。10、對新的TTTY15-USP9Y的序列進(jìn)行功能域的預(yù)測11、運用免疫熒光Western Blot檢測編碼蛋白12、對原始的母基因TTTY15,及USP9Y在融合位點之前與之后進(jìn)行干擾,檢測干擾效率13、運用劃痕實驗,EDU實驗,周期檢測,凋亡檢測等方法探討融合基因的功能14、將原始的USP9Y的5’UTR區(qū)與融合后的新的5’UTR區(qū)進(jìn)行比較15、將原始的USP9Y的啟動子與新的融合基因的啟動子進(jìn)行功能比較研究結(jié)果:1、在前列腺癌的相關(guān)細(xì)胞系中進(jìn)行融合基因表達(dá)量的鑒定,確認(rèn)優(yōu)勢亞型為TTTY15-USP9Y-480,并確認(rèn)優(yōu)勢表達(dá)的細(xì)胞為DU145。2、在腸癌細(xì)胞,腎細(xì)胞,及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,肝癌細(xì)胞中以及DU145中進(jìn)行融合基因TTTY15-USP9Y的檢測發(fā)現(xiàn),TTTY15-USP9Y-480在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)量最高。3、建立單克隆細(xì)胞株-前列腺癌細(xì)胞系DU145,通過對短期內(nèi)建系的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行DNA層面及RNA層面的鑒定,確認(rèn)TTTY15-USP9Y的融合不是DNA層面的行為,為RNA層面的嵌合。4、利用crispr/cas9技術(shù)對前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行DNA層面的雙打靶,成功構(gòu)建,并挑選出TTTY15與USP9Y準(zhǔn)確對接的單克隆細(xì)胞株,人工的構(gòu)建了TTTY15-USP9Y融合基因的純系細(xì)胞系。5、通過對人工構(gòu)建的融合基因細(xì)胞系進(jìn)行RNA及DNA層面的鑒定,進(jìn)一步印證,融合基因的發(fā)生確實具有RNA層面精確的剪接方式及偏好,并進(jìn)一步提示出融合基因的發(fā)生是RNA層面的順式剪接。6、根據(jù)新的融合基因的序列進(jìn)行功能區(qū)的預(yù)測,結(jié)果顯示功能區(qū)沒有發(fā)生改變,原始的蛋白編碼區(qū)沒有被破壞。7、免疫熒光試驗及Western Blot實驗結(jié)果顯示,USP9Y蛋白在DU145細(xì)胞株中表達(dá)量最高,主要集中在胞質(zhì)中。8、對原始母基因融合位點前后的干擾差異,相關(guān)功能實驗證實,融合基因具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增值的能力,可以促使前列腺癌細(xì)胞加速進(jìn)入G2期。促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移能力,侵襲能力。9、原始的USP9Y的5’UTR區(qū)與融合后的新的5’UTR區(qū)進(jìn)行比較,有一定的差異,但是沒有達(dá)到具有統(tǒng)計學(xué)意義的差距。10、原始的USP9Y的啟動子與新的融合基因的啟動子進(jìn)行功能比較,差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。融合后的TTTY15-USP9Y的啟動子區(qū)明顯強于原USP9Y的啟動子。結(jié)論:中國人前列腺癌組織中確實存在TTTY15-USP9Y的融合,其在前列腺癌細(xì)胞系中也存在。TTTY15-USP9Y基因融合共有四個亞型,無論是在中國人的前列腺癌組織中,還是在西方人組織建株的前列腺細(xì)胞系中,都是以TTTY15-USP9Y-480為優(yōu)勢亞型。根據(jù)相關(guān)實驗證實,TTTY15-USP9Y融合基因為RNA層面的行為。本課題通過一系列的實驗證實,融合基因強烈上調(diào)了USP9Y的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增值及相關(guān)腫瘤特征。并進(jìn)一步探索出,融合基因的新啟動子區(qū)在此過過程中發(fā)揮了重要作用。根據(jù)前列腺癌組織的測序信息,設(shè)計引物在前列腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行pcr之后單克隆化,鑒定出TTTY15-USP9Y的融合確實存在,并且含有四個亞型。研究背景:miRNA通過多種方式參與調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、增殖、凋亡及應(yīng)激反應(yīng),對細(xì)胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用,miRNA的表達(dá)異常是惡性腫瘤的一個重要特征。相較于其他領(lǐng)域,前列腺相關(guān)的miRNA的研究起步是較晚的。且研究的規(guī)模的較小,重復(fù)驗證的較少。而一個理想的診斷標(biāo)志物需要在大規(guī)模的樣本篩查中表現(xiàn)穩(wěn)定。目的:篩選前列腺癌與癌旁組織中表達(dá)差異顯著的miRNA,探討MiR-182-5P對前列腺癌增殖、凋亡、侵襲方面的影響。方法:1、在PC3、LNCa P、RWPE、DU145、22RV1、C42前列腺相關(guān)細(xì)胞系中運用RT-PCR方法檢測MiR-182-5P的表達(dá)。合成MiR-182-5P的agomir,antagomir,agomir NC,antagomir NC用以進(jìn)行miRNA的功能研究。通過clontech的miRNA特異轉(zhuǎn)染試劑Xfect?siRNA Transfection Reagent,轉(zhuǎn)染前列腺癌DU145,LNCa P細(xì)胞系,檢測MiR-182-5P表達(dá)的變化。運用Edu試劑盒檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的變化;運用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡的變化;劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化;Transwell檢測細(xì)胞系侵襲能力的變化。從各個方面探討MiR-182-5P在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。2、利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其啟動子區(qū)是否存在ar結(jié)合位點,利用chip實驗驗證相關(guān)預(yù)測位點是否有AR的結(jié)合。利用DHT及mdv3100刺激雄激素受體陽性的細(xì)胞系觀察MiR-182-5P的表達(dá)水平是否受AR變化的影響。運用RT-PCR方法檢測MiR-182-5P與AR下游靶之間的關(guān)系。3、利用生物信息學(xué)方法即miRbase、star Base、Tarbase、target Scan等相關(guān)數(shù)據(jù)庫預(yù)測MiR-182-5P可能的靶基因,把其與65對測序結(jié)果中,癌組織里下調(diào)的基因進(jìn)行取交集。之后對篩選出的靶基因根據(jù)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行排序,優(yōu)選了6個與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并在腫瘤組織高通量測序中下調(diào)的靶基因。之后利用RT-PCR方法、Western Blot和雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證靶基因。并進(jìn)一步探討MiR-182-5P在前列腺癌中相關(guān)作用的機制。4、運用Western Blot,周期檢測,凋亡水平檢測,以及劃痕實驗檢測182的補償效果,以及ARRDC3,ITGb4對于MiR-182-5P的補償能力。5、培養(yǎng)細(xì)胞,對細(xì)胞進(jìn)行MiR-182-5P的過表達(dá),選取10只5周齡的雄性裸鼠,進(jìn)行皮下荷瘤實驗。觀察腫瘤的生成與生長速度的變化,并對腫瘤組織行Ki67的免疫組化實驗。研究結(jié)果:1、通過組織RNA sequence測序,發(fā)現(xiàn)一批miRNA存在組間差異,后經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MiR-182-5P差異倍數(shù)在5倍以上,組間差異較顯著。后經(jīng)realtime pcr實驗驗證,其在前列腺癌的表達(dá)量顯著高于非癌組織。2、MiR-182-5P在du145中表達(dá)量較低,適合進(jìn)行過表達(dá)的檢測。過表達(dá)MiR-182-5P的處理組侵襲能力更強,抑制組侵襲能力有下降。3、MiR-182-5P表達(dá)水平的變化可影響AR下游靶。并存在于ar與下游靶之間的通路上。4、實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MiR-182-5P agomir可明顯抑制p MIR-REPORTARRDC3-3’UTR-Wt的熒光素酶活性。5、過表達(dá)MiR-182-5P對細(xì)胞周期,凋亡及遷移能力造成的影響可通過抑制ITGb4進(jìn)行補償,抑制MiR-182-5P對前列腺癌細(xì)胞造成的影響可通過干擾ARRDC3予以平衡。6、裸鼠體內(nèi)荷瘤實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)MiR-182-5P可明顯促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展。結(jié)論:MiR-182-5P在癌與癌旁組織中表達(dá)差異明顯。MiR-182-5P能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、抑制前列腺癌細(xì)胞的早期凋亡,該miRNA對于前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力具有重要作用。MiR-182-5P與AR相關(guān),受到AR的調(diào)控。MiR-182-5P是通過直接與ARRDC3 3’UTR區(qū)結(jié)合,下調(diào)ARRDC3的表達(dá),從而發(fā)揮促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖,侵襲的作用。MiR-182-5P的穩(wěn)定表現(xiàn)有望作為新的臨床診斷標(biāo)志物及治療干預(yù)的靶點。MiR-182-5P可直接作用于ARRDC3,MiR-182-5P可影響ARRDC3的相關(guān)結(jié)合蛋白。MiR-182-5P在體內(nèi)也可明顯促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 姚靜靜;前列腺癌相關(guān)基因TTTY15-USP9Y及mirna-182-5p功能機制的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

，

本文編號：1610423