本文選題：前列腺癌　切入點：融合基因　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:前列腺癌是全世界發(fā)病率最高的男性惡性腫瘤,無論是在美國還是是在中國都是男性高發(fā)的疾病,并在近些年的中國患者中呈明顯上升趨勢。前列腺的研究存在兩個顯著的困境,一是有效地治療靶點,在手術療法、內分泌療法、放化療法和生物療法等治療手段不斷發(fā)展的基礎上,局限性前列腺癌的治愈率在不斷提高,但總死亡率仍是居高不下,根源于治愈患者的復發(fā)并進展為激素抵抗的轉移性前列腺癌。因此,研究前列腺癌浸潤及轉移的分子機制,發(fā)現新的前列腺癌的治療靶點成為目前前列腺癌研究的重點。二是診斷的標志物,目前一系列的治療手段均參考于血清PSA的水平。PSA檢測的弊端在于假陽性,導致不必要的穿刺和治療負擔。很多年來,研究者們包括臨床工作者致力于尋找更加特異的診斷方式,診斷標志物。包括近年興起的有關前列腺癌的miRNA的研究,Lnc RNA的研究,PSA異構體的研究,PSA聯合長聯非編碼RNA的共同診斷,血清環(huán)狀RNA的研究,前列腺癌外泌體及外泌體相關miRNA,蛋白的研究,融合基因的研究。各個領域都力圖尋找到優(yōu)異的前列腺癌診斷標志物和治療靶點。融合基因最早成名于血液病中的費城染色體,其開啟了有關人腫瘤領域的融合基因的研究。該融合基因在血液腫瘤中具有良好的診斷效率,并為該型血液病的治療提供了支持與指導。在此經典融合基因之后,各腫瘤領域相繼展開了組織特異性融合基因的探索。有礙于當時科研技術水平的限制,融合基因難以被檢測發(fā)現,伴隨著不斷的測序技術發(fā)展,腫瘤數據庫的不斷完善,一些基因的融合被探測出來。前列腺癌領域最早,最經典的融合基因是ETS家族相關的融合基因。該融合基因包含很多種亞型。到此時期,相關的已發(fā)現的融合基因,都是經典的DNA層面的融合。這種融合帶來了優(yōu)秀的診斷效率和預后指導。伴隨著基因測序技術的逐步完善,發(fā)現了一些嵌合體RNA,相比較于DNA層面的融合,嵌合體RNA有更好的靈活性,更豐富的剪接方式,極大地擴充了有限的人類蛋白編碼基因的范疇,使得人體能夠在基因有限的情況下,擁有更豐富的編碼蛋白或基因調控方式。而這個時期的嵌合體RNA幾乎指的都是反式剪接,并且反式剪接最早并不是發(fā)現于人類基因組,經典的反式剪接首先在錐蟲和線蟲被發(fā)現,后期發(fā)現在人類身上。僅此一步,已為融合基因的豐富性打下了良好的基礎。近年,有關嵌合體的研究中發(fā)現了SLC45A3-ELK4,該嵌合RNA經過相關實驗論證認為其不是DNA層面的行為,而是RNA層面的行為,并對其為順式剪接還是反式剪接行為進行了論證。研究傾向認為,該嵌合體RNA為read through之后的順式剪接,意味著,融合基因的領域又多了一種存在形式,一種更加靈活的形式。目的:鑒定融合基因在前列腺癌組織與前列腺癌相關細胞系中是否真實存在,鑒定該融合基因可能擁有的亞型,鑒定該融合基因是否為DNA層面的行為。探索這種融合基因在前列腺癌細胞中的功能。探索該融合基因的作用機制;篩選前列腺癌與癌旁組織中表達差異顯著的miRNA,探討MiR-182-5P對前列腺癌增殖、凋亡、侵襲方面的影響。方法:1、在DU145、PC3、LNCa P、22RV1、C42前列腺相關細胞系中運用PCR單克隆化的方法檢測TTTY15-USP9Y是否真實存在,鑒別其包含的不同亞型2、在DU145、PC3、LNCa P、RWPE、22RV1、C42前列腺相關細胞系中運用RT-PCR方法檢測TTTY15-USP9Y的表達。3、在結腸癌細胞,腎細胞,及臍帶間充質干細胞,肝癌細胞中以及DU145中進行融合基因TTTY15-USP9Y的檢測4、Northern blot對TTTY15-USP9Y的鑒定6、構建優(yōu)勢表達細胞系DU145的純系單克隆細胞株7、步移PCR對純系單克隆細胞株中TTTY15-USP9Y的DNA層面及RNA層面進行鑒定。8、利用crispr/cas9技術對優(yōu)勢表達的細胞株進行DNA層面的雙打靶,并對細胞進行單克隆化,挑選拼接準確的單克隆細胞系,人工構建具有TTTY15-USP9Y融合基因的細胞株。9、對人工構建后的細胞株進行DNA層面及RNA層面的鑒定,進一步幫助確認融合基因發(fā)生的層面。10、對新的TTTY15-USP9Y的序列進行功能域的預測11、運用免疫熒光Western Blot檢測編碼蛋白12、對原始的母基因TTTY15,及USP9Y在融合位點之前與之后進行干擾,檢測干擾效率13、運用劃痕實驗,EDU實驗,周期檢測,凋亡檢測等方法探討融合基因的功能14、將原始的USP9Y的5’UTR區(qū)與融合后的新的5’UTR區(qū)進行比較15、將原始的USP9Y的啟動子與新的融合基因的啟動子進行功能比較研究結果:1、在前列腺癌的相關細胞系中進行融合基因表達量的鑒定,確認優(yōu)勢亞型為TTTY15-USP9Y-480,并確認優(yōu)勢表達的細胞為DU145。2、在腸癌細胞,腎細胞,及臍帶間充質干細胞,肝癌細胞中以及DU145中進行融合基因TTTY15-USP9Y的檢測發(fā)現,TTTY15-USP9Y-480在前列腺癌細胞中表達量最高。3、建立單克隆細胞株-前列腺癌細胞系DU145,通過對短期內建系的單克隆細胞株進行DNA層面及RNA層面的鑒定,確認TTTY15-USP9Y的融合不是DNA層面的行為,為RNA層面的嵌合。4、利用crispr/cas9技術對前列腺癌細胞進行DNA層面的雙打靶,成功構建,并挑選出TTTY15與USP9Y準確對接的單克隆細胞株,人工的構建了TTTY15-USP9Y融合基因的純系細胞系。5、通過對人工構建的融合基因細胞系進行RNA及DNA層面的鑒定,進一步印證,融合基因的發(fā)生確實具有RNA層面精確的剪接方式及偏好,并進一步提示出融合基因的發(fā)生是RNA層面的順式剪接。6、根據新的融合基因的序列進行功能區(qū)的預測,結果顯示功能區(qū)沒有發(fā)生改變,原始的蛋白編碼區(qū)沒有被破壞。7、免疫熒光試驗及Western Blot實驗結果顯示,USP9Y蛋白在DU145細胞株中表達量最高,主要集中在胞質中。8、對原始母基因融合位點前后的干擾差異,相關功能實驗證實,融合基因具有促進前列腺癌細胞增值的能力,可以促使前列腺癌細胞加速進入G2期。促進前列腺癌細胞的遷移能力,侵襲能力。9、原始的USP9Y的5’UTR區(qū)與融合后的新的5’UTR區(qū)進行比較,有一定的差異,但是沒有達到具有統(tǒng)計學意義的差距。10、原始的USP9Y的啟動子與新的融合基因的啟動子進行功能比較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義。融合后的TTTY15-USP9Y的啟動子區(qū)明顯強于原USP9Y的啟動子。結論:中國人前列腺癌組織中確實存在TTTY15-USP9Y的融合,其在前列腺癌細胞系中也存在。TTTY15-USP9Y基因融合共有四個亞型,無論是在中國人的前列腺癌組織中,還是在西方人組織建株的前列腺細胞系中,都是以TTTY15-USP9Y-480為優(yōu)勢亞型。根據相關實驗證實,TTTY15-USP9Y融合基因為RNA層面的行為。本課題通過一系列的實驗證實,融合基因強烈上調了USP9Y的表達,進一步促進了前列腺癌細胞的增值及相關腫瘤特征。并進一步探索出,融合基因的新啟動子區(qū)在此過過程中發(fā)揮了重要作用。根據前列腺癌組織的測序信息,設計引物在前列腺癌細胞系中進行pcr之后單克隆化,鑒定出TTTY15-USP9Y的融合確實存在,并且含有四個亞型。研究背景:miRNA通過多種方式參與調控細胞的發(fā)育、增殖、凋亡及應激反應,對細胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用,miRNA的表達異常是惡性腫瘤的一個重要特征。相較于其他領域,前列腺相關的miRNA的研究起步是較晚的。且研究的規(guī)模的較小,重復驗證的較少。而一個理想的診斷標志物需要在大規(guī)模的樣本篩查中表現穩(wěn)定。目的:篩選前列腺癌與癌旁組織中表達差異顯著的miRNA,探討MiR-182-5P對前列腺癌增殖、凋亡、侵襲方面的影響。方法:1、在PC3、LNCa P、RWPE、DU145、22RV1、C42前列腺相關細胞系中運用RT-PCR方法檢測MiR-182-5P的表達。合成MiR-182-5P的agomir,antagomir,agomir NC,antagomir NC用以進行miRNA的功能研究。通過clontech的miRNA特異轉染試劑Xfect?siRNA Transfection Reagent,轉染前列腺癌DU145,LNCa P細胞系,檢測MiR-182-5P表達的變化。運用Edu試劑盒檢測轉染前后細胞增殖能力的變化;運用流式細胞術檢測細胞周期及凋亡的變化;劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化;Transwell檢測細胞系侵襲能力的變化。從各個方面探討MiR-182-5P在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。2、利用生物信息學方法預測其啟動子區(qū)是否存在ar結合位點,利用chip實驗驗證相關預測位點是否有AR的結合。利用DHT及mdv3100刺激雄激素受體陽性的細胞系觀察MiR-182-5P的表達水平是否受AR變化的影響。運用RT-PCR方法檢測MiR-182-5P與AR下游靶之間的關系。3、利用生物信息學方法即miRbase、star Base、Tarbase、target Scan等相關數據庫預測MiR-182-5P可能的靶基因,把其與65對測序結果中,癌組織里下調的基因進行取交集。之后對篩選出的靶基因根據預測結果進行排序,優(yōu)選了6個與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關,并在腫瘤組織高通量測序中下調的靶基因。之后利用RT-PCR方法、Western Blot和雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證靶基因。并進一步探討MiR-182-5P在前列腺癌中相關作用的機制。4、運用Western Blot,周期檢測,凋亡水平檢測,以及劃痕實驗檢測182的補償效果,以及ARRDC3,ITGb4對于MiR-182-5P的補償能力。5、培養(yǎng)細胞,對細胞進行MiR-182-5P的過表達,選取10只5周齡的雄性裸鼠,進行皮下荷瘤實驗。觀察腫瘤的生成與生長速度的變化,并對腫瘤組織行Ki67的免疫組化實驗。研究結果:1、通過組織RNA sequence測序,發(fā)現一批miRNA存在組間差異,后經統(tǒng)計學分析,發(fā)現MiR-182-5P差異倍數在5倍以上,組間差異較顯著。后經realtime pcr實驗驗證,其在前列腺癌的表達量顯著高于非癌組織。2、MiR-182-5P在du145中表達量較低,適合進行過表達的檢測。過表達MiR-182-5P的處理組侵襲能力更強,抑制組侵襲能力有下降。3、MiR-182-5P表達水平的變化可影響AR下游靶。并存在于ar與下游靶之間的通路上。4、實驗結果顯示,轉染MiR-182-5P agomir可明顯抑制p MIR-REPORTARRDC3-3’UTR-Wt的熒光素酶活性。5、過表達MiR-182-5P對細胞周期,凋亡及遷移能力造成的影響可通過抑制ITGb4進行補償,抑制MiR-182-5P對前列腺癌細胞造成的影響可通過干擾ARRDC3予以平衡。6、裸鼠體內荷瘤實驗結果顯示,過表達MiR-182-5P可明顯促進腫瘤的形成和發(fā)展。結論:MiR-182-5P在癌與癌旁組織中表達差異明顯。MiR-182-5P能夠促進前列腺癌細胞的增殖、抑制前列腺癌細胞的早期凋亡,該miRNA對于前列腺癌細胞的侵襲能力具有重要作用。MiR-182-5P與AR相關,受到AR的調控。MiR-182-5P是通過直接與ARRDC3 3’UTR區(qū)結合,下調ARRDC3的表達,從而發(fā)揮促進前列腺癌細胞的增殖,侵襲的作用。MiR-182-5P的穩(wěn)定表現有望作為新的臨床診斷標志物及治療干預的靶點。MiR-182-5P可直接作用于ARRDC3,MiR-182-5P可影響ARRDC3的相關結合蛋白。MiR-182-5P在體內也可明顯促進腫瘤的形成與發(fā)展。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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1 姚靜靜;前列腺癌相關基因TTTY15-USP9Y及mirna-182-5p功能機制的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

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本文編號：1610423