本文選題：腎移植　切入點：HLA配型　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人類白細胞抗原(HLA)是人體主要組織相容性基因(MHC),介導實體器官移植中的超急性、加速性、急性和慢性排斥反應,是器官移植免疫反應中的首要角色。HLA配型的應用使得腎移植后超急性和加速性嚴重排斥反應罕見發(fā)生,急性排斥已經成為影響腎移植后人／腎近期和遠期生存率的最重要因素。2001年美國聯(lián)邦立法將HLA配型列入器官移植技術標準,2006年中國衛(wèi)生部將HLA配型列入器官移植管理法規(guī)。 腎移植進行供受者HLA配型的必要性無容置疑,其目的就是測定供體與受體HLA相容性程度,力求使排斥反應減小到最低程度。同時,移植受者由于接觸過同種HLA抗原而產生的抗-HLA抗體,必須通過PRA檢測來反映受者體內抗-HLA抗體體液免疫狀態(tài),從而準確預測腎移植后超急性和加速等嚴重排斥反應的發(fā)生和排斥反應的強度,有效改善腎移植近期效果和遠期效果。而目前國內外公認腎臟移植配型許可的標準為：供受者淋巴毒交叉配型陰性、通過PRA檢測確認受者不存在不可接受的供者HLA基因、進行供腎與受者HLA相合(MM)程度的評估。其中,供受者淋巴細胞毒交叉配型為陽性或受者存在針對供者HLA的特異性抗體時,被視為腎臟移植的禁忌指標,但是供受者HLA相合程度的未見具體的標準。 盡管近年來對MICA、KIR、調節(jié)性T細胞(Treg)等與腎移植的相關研究十分熱烈,但都遠遠不足于動搖HLA在獲得最佳腎移植效果中無可替代的地位。主要體現(xiàn)在如下幾方面： 1.HLA作為人體免疫系統(tǒng)的核心,是人類的免疫應答基因,同時也是遺傳標記物,研究證實某些HLA基因與終末期腎臟病(ESRD)的存在易感關聯(lián),這種易感關聯(lián)具有種族和地域差異。同時,ESRD患者的家族聚集性,也提示了存在相關的易感基因的可能。研究兩者間的易感關聯(lián),有助于闡明ESRD的發(fā)病機制,而且HLA作為一種疾病發(fā)生的遺傳標志可用于ESRD的易感預測、鑒別診斷、病因分類、治療及預后分析。 2.HLA生物學功能體現(xiàn)在抗原識別、處理和遞呈、約束免疫細胞之間的相互作用、參與T細胞活化通路的多個環(huán)節(jié)、特異性免疫調節(jié)、免疫應答(激活、抑制),將外來抗原(供者)提呈給相應T細胞受體,從而激發(fā)免疫細胞克隆、增殖和分化,導致移植排斥反應的發(fā)生最終導致移植物失功。研究發(fā)現(xiàn),供受者HLA相合程度越高,則腎移植受者術后出現(xiàn)PRA陽性機會越低、移植物排斥反應幾率越少、移植物有功能存活時間越長、移植后所需排斥藥物的血藥濃度水平越低。因而HLA相合率已經成為臨床醫(yī)師決定移植供受者的重要因素。 3.移植受體內存在HLA抗體(PRA)對臨床腎移植有重要的影響。PRA作為一種IgG類型的體液免疫性抗體,能特異性地針對供者的HLA抗原,這種HLA抗體能夠直接殺傷移植腎細胞,是引起超急性排斥、加速性排斥反應、急性排斥反應和慢性排斥反應和最終導致移植物失功的元兇。 但是,HLA與ESRD的發(fā)生、發(fā)展的相關性以及在腎移植中應用中仍存在許多問題有待解決。例如：(1)HLA與ESRD的易感關聯(lián),確切機制至今未明；HLA本身在腎移植中的作用,包括HLA與移植物失功的易感關聯(lián)有待進一步研究。(2)已知HLA相合率對移植物長期生存有決定性的作用,而HLA相合率對移植近期效果的影響的研究較少。另外,供腎的匱乏與追求供腎的HLA高度相合之間存在矛盾,如何在兩者間取得平衡,使得在盡量縮短受者移植輪候時間的同時,獲得理想的HLA相合分數的移植有待研究。(3)PRA陽性受者存在不可接受的HLA基因必然導致其獲得移植機會減少,等待時間相應增加,為使臨床醫(yī)師預先了解致敏受者與任何供者交叉配型陽性的可能性、為選擇移植腎來源提供數據支持,建立一種能反映PRA陽性患者與供者不相容的的真實幾率的校正PRA(CPRA)方法的需求,顯得非常迫切。 第一章中國南方ESRD患者HLA易感關聯(lián)研究 目的 (1)對中國南方ESRD患者中HLA的表達進行分析,探討HLA與ESRD的易感風險。 (2)對腎移植術后5年內移植腎失功與HLA多態(tài)性進行相關性研究,探討HLA在移植腎失功中的臨床應用價值。 材料與方法 (1)收集2000年1月-2013年6月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院、中國人民解放軍第458醫(yī)院等16家移植中心登記等候腎臟移植的ESRD患者,年齡、性別不限。通過病歷復習選擇HLA基因分型資料完整的ESRD患者4670例。健康對照組為2686例南方漢族對照來自廣州市中心血站和深圳市中心血站的健康獻血者。 (2)采集2000年1月～2009年2月腎移植手術病例且持續(xù)隨訪5年以上的受者896例(年齡、性別不限、HLA基因分型資料完整),其中術后移植腎5年內失功即血肌酐升至707μmol/L以上行透析治療的的受者50例,列為移植腎失功組；術后5年腎功能仍然正常,血肌酐150μmol/L的受者701例,列為對照組。 留取EDTA抗凝血3ml,采用PCR-SSP分型方法進行HLA-A、B、DR基因分型。HLA基因的表現(xiàn)型頻率PF=n/N,基因頻率GF=1-(1-n/N)1/2,采用卡方檢驗對病例組與對照組的HLA-A、B、DRB1基因頻率逐一進行關聯(lián)分析(當某一位點表現(xiàn)為兩個相同的基因,即純合子時,計作一個)。必要時采用Yates檢驗方法與Fisher確切概率法計算確切P值。多重比較采用Bonferroni方法校正檢驗水準α值,Pc值≤0.05具有統(tǒng)計學意義,同時按Woolf公式計算相對危險度(RR)的比值比(OR)及95%的可信區(qū)間(CI),均數比較用兩樣本t檢驗,率的比較用卡方檢驗,均為雙側檢驗,檢驗水準a=0.05。 結果 4670例ESRD患者中,男性3068人,女性1602人,男：女=2.04：1,平均年齡(43.74±13.50)歲。原發(fā)病按比例由多到少依次為：慢性腎小球腎炎尿毒癥76.08%糖尿腎病5.96%其他原因5.91%病因不詳5.01%多囊腎并尿毒癥3.13%高血壓腎病2.16%雙腎多發(fā)性結石1.24%紅斑狼瘡性腎病0.54%。比較HLA基因在ESRD組和健康對照組間的分布,經Pc校正之后兩組間HLA-A1、A3、A11、A24、A30、A31、A32、B7、B8、B38、B44、B46、B52、 B56、B57、B60、B61、B62、B67、B71、B75、DR1、DR4、DR7、DR8、DR12、 DR13、DR14和DR16頻率的差異有統(tǒng)計學意義(Pc0.05)。0OR1的有HLA-A1、A3、A30、A31、A32、B7、B8、B44, B52、B57、B61、B62、B67、B71、DR1、DR7和DR13,OR1的有A11、A24、B38、B46、B56、B60、B75、DR4、DR12和DR14。 比較移植腎失功組與對照組HLA多態(tài)性分布的差異,失功組HLA-DR17的頻率顯著高于對照組(PF=0.372VS0.120, Pc=0.00, OR=4.50)。 結論 研究顯示,HLA-A11、A24、B38、B46、B56、B60、B75、DR4、DR12和DR14基因可能為中國南方漢族ESRD的易感基因；HLA-A1、A3、A30、A31、 A32、HLA-B7、B8、B44、B52、B57、B61、B62、B67、B71、DR1、DR7和DR13基因可能為中國南方漢族ESRD的抵抗基因；HLA-DR17本身可能就是導致移植腎5年內失功的高危因素。HLA多態(tài)性可能是導致移植效果差異的原因之一,但是HLA的表達及其多態(tài)性在因各類腎臟疾病導致最終并發(fā)ESRD進程中的免疫遺傳易感性及相關危險性作用機制,仍未明確,有待進一步研究。 第二章腎移植供受者HLA相合分析及其對腎移植效果的影響 目的 對腎移植供受者HLA相合分數進行分析,探討供受者HLA-A、B、DRDQ相合率對腎移植后3年效果的影響。 材料與方法 收集2006年1月～2011年12月期間在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院和中國人民解放軍第四五八醫(yī)院完成初次尸體腎移植的受者資料428例,受者需符合供受者HLA基因分型資料完整、受者術前PRA陰性、術后持續(xù)隨訪37個月。采集術后發(fā)生急性排斥(AR)以及3年內受者有功能生存的情況。參照美國器官共享聯(lián)合網絡(UNOS)的策略,計算供受者間HLA-A、B、DRDQ四個座位的相合率,同一座位的基因有1個相同記為1分,2個基因相同記為2分,無相同基因記為0分,四個座位分數相加即為HLA相合率。按照供受者HLA相合率分數,即0、1、2、3、4、5、6、7、8分,共分為9組,并以供受者HLA相合率0～8分為節(jié)點,分為0-8分組合組。對供受者之間HLA、B、DRDQ的相合分數進行,并分析HLA相合分數與移植后3年內移植腎AR、受者有功能生存的相關性。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,組間均數比較用兩樣本t檢驗,率的比較用卡方檢驗,必要時采用Yates檢驗方法與Fisher確切概率法計算確切P值,均為雙側檢驗,檢驗水準α=0.05。 結果 428例接受初次腎移植受者的平均年齡為(41.81±11.32)歲,HLA-A、B、DR、DQ的4個位點8個基因相合分數的平均值為(3.01±1.48)分,其中HLA-A、B、 DR, DQ位點相合分數的平均值分別(0.87±0.63)分、(0.59±0.58)分、(0.69±0.62)分和(0.85±-0.06)分,相合分數由高到低依次為A位點DQ位點DR位點B位點。HLA-A、B、DR、DQ單個位點的相合分數為0分的比例,由高到低的順序依次為B位點DR位點A位點DQ位點,1分相合的百分比為DQ位點A位點DR位點B位點,2分相合的百分比為A位點DQ位DR位點B位點。HLA相合率0-8分組中比例最多的是3分組,占總對數的28.7%,其次是2分組和4分組,占23.1%和18.2%,相合數為8分僅為2對,占0.5%,HLA相合率的分布呈2-4分組較多,0分及7-8分少的趨勢。428例腎移植受者術后AR率為17.76%,HLA相合分數0～8分組中AR率最高為0分組(33.33%),AR率從高到低排列依次為0分2分1分7分3分6分5分4分8分,分別0-9分組間的AR率的差異進行比較,其中HLA相合2分組與4分組之間AR率的差異存在統(tǒng)計學意義(P=0.03),其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。以供受者HLA相合分數0-8分為節(jié)點劃分為8對0-8分的組合組,其中相合分數3分的組合組的AR率均30%,其中0-1分組合組AR率最高,為34.04%；相合分數13分的組合組,AR率均10%。分別對8對組合組之間的AR率進行比較,0-1分組合組與2-8分組合組、0-2分組合組與3-8分組合組、0-3分組合組與4-8分組合組、0～4分組合組與5～8分組合組、0-5分組合組與6-8分組合組、0-6分組合組與7-8分組合組以及0-7分組合組與8分組之間AR率的差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),并以HLA相合率0～2分與3-8分組合組之間差異性最大(x2=26.40)；0分組與1-8分組合組之間AR率的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。428例腎移植受者移植1年人/腎存活率為95.33%,2年人/腎存活率為92.76%,3年人/腎存活率為91.12%。0-8分組按1年人/腎存活率從高到低排列,依次為HLA相合率8分=7分=6分4分1分3分5分2分0分組,3年人/腎存活率從高到低排列依次為8分=7分4分6分5分3分1分2分0分組。 結論 由于HLA存在的高度多態(tài)性,導致供受者之間腎移植受者獲得HLA-A、B、DRDQ全相合供者的幾率極低。本研究真實地反應了由移植醫(yī)師選擇腎移植供受者的HLA相合分數為(3.01±1.48)分。研究證實,HLA相合率對初次移植腎的近期效果具有顯著影響,供受者間HLA相合率越高,術后發(fā)生排異反應等幾率越低,尤其當HLA相合分數≥3分時,移植后AR率降低明顯。研究提示,為了獲得良好的腎移植近期效果,同時提高移植腎的長期存活率,初次腎移植受者應盡量選擇供受者HLA相合率≥3分的供者,盡量避免選擇供受者相合分數0-1分的供者。 第三章采用校正PRA方法分析HLA抗體陽性受者獲得腎臟移植的幾率 目的 建立一種分析PRA陽性患者與供者不相容幾率的校正PRA(CPRA)方法,采用校正PRA(CPRA)方法分析臨床腎移植中受者獲得移植物的幾率。 方法 收集2000年1月～2012年12月間在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院及中國人民解放軍第四五八醫(yī)院進行移植、且HLA基因分型資料完整供者共2004例；收集2008年1月～2012年12月間在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院及中國人民解放軍第四五八醫(yī)院等候腎移植的PRA陽性(PRA強度為峰值)的受者202例。采用PCR-SSP方法對2004例供者進行HLA-A、B、DR分型并建立供者HLA數據庫,應用Arlequin軟件3.11計算單個HLA-A、B、DR基因以及A-B、A-DR、B-DR和A-B-DR單倍型出現(xiàn)的頻率,以此為基礎建立了CPRA-Java計算軟件,將PRA特異性結果作為不同接受的HLA基因,并在CPRA計算軟件中輸入各種基因組合時,即可獲得一個CPRA的百分數,以代表不可接受HLA基因在該供者群體中所占的期望值百分比。采用ELISA方法對202例PRA陽性受者的血清進行HLA抗體確定實驗,分析PRA強度(%)和HLA抗體特異性,將202例PRA特異性抗體作為不可接受的HLA基因,計算相應的CPRA值。按照PRA致敏程度,分別比較低度致敏(PRA0-10%)、中度致敏(PRA10～30%)和高度致敏(PRA30%)與該致敏程度CPRA的平均強度的差異；比較PRA低、中、高致敏組中CPRA值(0-10%、10-30%和30%)的分布情況,對PRA強度和CPRA值的均值進行一致性比較。CPRA值與PRA強度均值的比較采用獨立樣本t檢驗。CPRA值與PRA強度一致率的計算使用kappa參數。數據處理采用SPSS13.0軟件,均為雙側檢驗,檢驗水準α=0.05。 結果 分析2004例供者的HLA-A、B、DR表達情況,將202例PRA陽性受者的HLA抗體特異性結果,輸入CPRA-Java軟件,獲得含全部不可接受基因的供者期望值頻數,即獲得相應的CPRA值。202例PRA陽性受者平均強度為(23.12±17.96)%, CPRA均值為(46.07±23.30)%。低度致敏者(PRA0-10%)占受者的30.69%(62/202),PRA平均強度為(6.87%±2.41)%,組中CPRA均值為(21.63±11.75)%,PRA平均強度與CPRA均值之間存在顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05)；中度致敏者(10-30%)占受者的45.049%(91/202),平均強度為(20.15±5.17)%,組中CPRA均值為(50.56±16.86)%,PRA平均強度與CPRA均值之間存在顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05)；高度致敏者(30%)占受者的24.26%,平均強度為(49.20±15.17)%,組中CPRA均值為(68.64±15.35)%,PRA平均強度與CPRA均值之間無顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05)。分別比較三種致敏程度中CPRA均值的差異,其中低度致敏組與中、高度致敏組的差異均存在統(tǒng)計學差異(P0.05),中度致敏組和高度致敏組之間CPRA均值的差異則不存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。分析PRA低、中、高致敏組中CPRA值(0-10%、10～30%和30%)分布的差異：低、中、高度致敏組PRA強度與CPRA值的一致率分別為19.36%、10.99%和100%,PRA強度與CPRA值的一致程度存在顯著的統(tǒng)計學差異(Kappa=0.09, P0.05)。 結論 本研究建立的CPRA方法,是通過分析供者HLA頻率建立數據庫計算PRA陽性受者不可接受的HLA基因組合在該供者群體中所占的百分比,即CPRA值。研究證明,應用PRA檢測HLA抗體呈低度致敏時受者實際獲得移植的幾率可能比PRA強度反映的低；而PRA30%時CPRA均30%,證實PRA30%為腎移植的高危因素。因此,高PRA受者選擇供腎更需慎重,必須進行準確可靠的PRA特異性檢測,避開既往曾出現(xiàn)過的全部不可接受HLA基因。傳統(tǒng)的PRA強度分析反映了腎移植受者自身的致敏程度,代表了交叉配型時與供者不相容的HLA基因,準確可靠的PRA特異性檢測其不可接受的HLA基因極為重要；在此基礎上,應用CPRA方法則可以如實反映受者獲得移植的幾率,為臨床醫(yī)師預測受者等待時間、選擇移植方式提供依據。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R699.2

【參考文獻】

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本文編號：1604781