本文選題：線粒體DNA　切入點：TLR9　出處：《南京大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是細胞表面模式識別受體 (Pattern recognition receptor, PRR),參與識別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),介導免疫細胞的激活,在天然免疫中起著重要作用。TLR9是免疫細胞專門識別病毒和細菌中非甲基化DNA(CpG-DNA)的模式識別受體,從而參與天然免疫。研究還發(fā)現(xiàn)TLR9也可表達于非免疫細胞如心肌細胞和疾病狀態(tài)下的足細胞。我們前期研究明確了TLR9參與嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside, PAN)誘導的足細胞凋亡,但尚未確定該模型中激活TLR9的配體。由于真核細胞線粒體起源于細菌,即由古細菌在真核細胞漿內(nèi)通過共生作用(endosymbiogenesis)進化而來,而且線粒體DNA(mtDNA)保留了CpG基序未甲基化的特性,因此,我們推測足細胞內(nèi)源mtDNA可能是TLR9的配體。本研究將驗證如下研究假說：PAN誘導mtDNA向溶酶體的轉(zhuǎn)移和積累,溶酶體內(nèi)的TLR9以mtDNA為配體,激活NFkB和p38 MAPK通路,進而促進足細胞凋亡。方法：1.建立體外培養(yǎng)足細胞的PAN損傷(凋亡)模型,明確TLR9表達水平、NF-κ B p65磷酸化、p38 MAPK磷酸化、以及細胞因子IL-12等的上調(diào)。2.將脫氧核糖核酸酶2 (Dnase2)過表達質(zhì)�；蚋蓴_質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入足細胞,以免疫印跡確定PAN誘導的NF-κB p65和p38 MAPK磷酸化的變化、以qRT-PCR確定IL-12的變化,以流式細胞術(shù)確定足細胞凋亡變化。3.通過免疫熒光染色對mtDNA與溶酶體進行共定位,明確PAN是否誘導細胞內(nèi)源mtDNA向溶酶體的轉(zhuǎn)移,從而確定在PAN誘導的足細胞損傷模型中mtDNA是激活TLR9的配體。4.制備PAN誘導大鼠足細胞損傷模型,以免疫組化檢測TLR9的表達、以qRT-PCR檢測大鼠腎小球中線粒體DNA量的變化、以qRT-PCR檢測腎小球凋亡標志物p53和Bax的表達,從而在活體水平驗證我們的研究假說。結(jié)果：(1)PAN處理的人永生化足細胞中,TLR9 mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)、NF-κ B p65和p38的磷酸化水平顯著上升、CD2AP表達顯著下調(diào)、足細胞凋亡率顯著升高,表明PAN誘導足細胞損傷建模成功。(2)CpG寡核苷酸(CpG ODN)能激活p38和p65,并激活NFκB熒光素酶報告基因的表達,證明足細胞內(nèi)存在具有功能的TLR9信號通路。(3)PAN處理使Picogreen和Lysotracker的熒光共定位顯著增加,由于Picogreen和Lysotracker分別顯示mtDNA和溶酶體的位置,表明PAN促進mtDNA在溶酶體中聚集,同時,足細胞內(nèi)mtDNA總量相應減少。(4)過表達Dnase2能減少PAN誘導的p38和p65磷酸化水平上調(diào),并減輕PAN-誘導的細胞凋亡。(5)轉(zhuǎn)染Dnase2干擾質(zhì)粒能進一步提高PAN誘導的p38和p65磷酸化水平,并且Dnase2干擾自身足以誘導足細胞凋亡。(6)PAN大鼠模型中,足細胞TLR9表達顯著上調(diào),mtDNA含量顯著下降,以及凋亡標志物p53和Bax顯著上調(diào),提示在活體狀態(tài)下,TLR9能以mtDNA為配體誘導足細胞的凋亡。結(jié)論：足細胞內(nèi)源mtDNA能作為TLR9的配體,通過激活TLR9信號通路,上調(diào)促凋亡的NFkB和p38 MAPK活性,從而參與PAN誘導的足細胞損傷。本研究提示mtDNA和TLR9可作為腎小球疾病的治療靶點。
[Abstract]:Objective: Toll like receptors (Toll-like receptors, TLRs) are pattern recognition receptors of cell surface (Pattern recognition receptor, PRR), in recognition of pathogen associated molecular patterns (Pathogen associated molecular pattern, PAMP), mediated by activation of immune cells, plays an important role in innate immune.TLR9 is unmethylated DNA specific immune cells identification of viruses and bacteria (CpG-DNA) pattern recognition receptors, and thus participate in innate immunity. The study also found that TLR9 can also be expressed in non immune cells such as myocardial cells and the condition of the foot cells. Our previous study identified TLR9 in puromycin aminonucleoside (puromycin aminonucleoside, PAN) - induced apoptosis of podocytes, but has not yet been determined TLR9 ligand activation of the model. Because of the eukaryotic cell mitochondria originated in bacteria, namely Archaea in eukaryotic cells by symbiosis (end Osymbiogenesis) evolved, and mitochondrial DNA (mtDNA) retains the characteristics of unmethylated CpG motifs therefore, we speculate that podocyte may be endogenous mtDNA ligands of TLR9. This study will verify the following hypothesis: PAN induced mtDNA to lysosomal transfer and accumulation of lysosomes of TLR9 using mtDNA as ligand NFkB and p38, activation of MAPK pathway, thereby promoting podocyte apoptosis. Methods: 1. in vitro culture PAN cell injury model (apoptosis), clear expression of TLR9, NF- kappa B p65 phosphorylation, p38 phosphorylation of MAPK, upregulation of.2. and cytokine IL-12 will deoxyribonuclease 2 (Dnase2) expression the interference plasmid or plasmid were transfected into Sertoli cells by Western blot, determine the changes of PAN induced by NF- B and p38 p65 kappa MAPK phosphorylation, qRT-PCR to determine the changes of IL-12, flow cytometry was used to determine the change of podocyte apoptosis by immune.3. Co localization of mtDNA fluorescent staining and lysosomes, to determine whether PAN cells induced by endogenous mtDNA to lysosomal transfer, to determine the podocyte injury model induced by PAN in mtDNA is the activation of the TLR9 ligand.4. preparation model of podocyte injury in rats induced by PAN expression by immunohistochemical detection of TLR9, changes in qRT-PCR detection mitochondrial DNA in rat glomerular volume, glomerular apoptosis detected by qRT-PCR marker p53 expression and Bax, in order to verify our hypothesis in vivo. Results: (1) human immortalized podocytes in PAN treatment, TLR9 mRNA and protein levels increased significantly, significantly increased NF- kappa B and p38 p65 the level of phosphorylated CD2AP expression was significantly reduced, the rate of podocyte apoptosis was significantly increased, suggesting that PAN induced podocyte injury model. (2) CpG (CpG ODN) oligonucleotide can activate p38 and p65, and the activation of NF kappa B luciferase reporter base Because the expression of podocyte that memory in the TLR9 signaling pathway has the function. (3) PAN to Picogreen and Lysotracker fluorescence co localization of Picogreen and Lysotracker increased significantly, due to show mtDNA and lysosomal location, indicating that PAN promotes mtDNA in lysosomal accumulation, at the same time, podocyte total mtDNA decreased. (4) overexpression of Dnase2 can reduce the PAN induced p38 and p65 phosphorylation level increased, and reduce the cell apoptosis induced by PAN-. (5) Dnase2 interference plasmid can improve PAN induced p38 and p65 phosphorylation, and Dnase2 interference itself is sufficient to induce podocyte apoptosis. (6) PAN rats in the model, podocyte TLR9 expression increased significantly, mtDNA content decreased and apoptosis markers p53 and Bax were significantly up-regulated, suggesting that in vivo, TLR9 with mtDNA as ligand induced podocyte apoptosis. Conclusion: endogenous podocyte MtDNA can act as a ligand of TLR9, and activate the TLR9 signaling pathway to upregulate the activity of NFkB and p38 MAPK, which is involved in PAN induced podocyte injury. This study indicates mtDNA and TLR9 can be used as therapeutic targets for glomerular diseases.

【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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